酵母双杂交（膜系统）服务-泰克生物-酵母展示服务专家

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酵母双杂交（膜系统）服务

泰克生物致力于全新的药物抗体，靶向多肽药物的技术开发服务。我们搭建了完善的酵母表面展示技术系统，经过多年的项目积累后，结合我们靶向肽筛选（细胞筛选，动物体内筛选）的经验，我们特推出了细胞内环境水平互作发现验证体系，即酵母杂交验证体系。化繁为简，我们采用改进的SMART技术为客户构建cDNA酵母文库并提供衍生出来的系列酵母杂交验证服务。

█ 酵母双杂交技术（膜杂交系统）基本原理

与酵母单杂交技术类似，酵母双杂交基本原理上也是基于真核酵母中的转录激活因子具有两个不同的结构域：DNA结合结构域（DNA binding domain，DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain，AD），这两个结构域的功能相互不影响，单独作用时不能发生激活转录效应，只有当二者在同一个细胞中且在空间上充分接近的时候，才能行使完整的转录激活因子的活性，使得下游基因得到转录。因此验证定位于细胞核内部的互作时，酵母单杂交技术与双杂交技术均可以采用GAL4转录因子作为报告体系，这种验证具有很大的局限性，当我们需要验证胞质内蛋白的相互作用时，这个系统难以胜任。科学家为了解决这种问题，开创性的开发了核外双杂交技术（又称为：酵母双杂交-膜杂交系统）。泰克生物为客户提供高质量的酵母双杂交（膜系统）服务，Yeast two-hybrid based on membrane 即Y2Hm服务，包括已知蛋白的互作验证、酵母双杂交（膜系统）文库的构建与筛选、基于酵母双杂交原理的蛋白自身的转录激活验证、膜蛋白与膜蛋白/胞质蛋白的互作验证等。

膜蛋白互作酵母双杂系统原理如图1所示：

膜系统酵母双杂交技术-泰克生物1.png

图1 膜蛋白互作酵母双杂系统示意图

膜蛋白互作酵母双杂系统是基于泛素（split-ubiquitin）介导的分离-合并-切割系统搭建的，泛素蛋白分成2个结构域：N端结构域（称为：Nub结构域）和C端结构域（称为：Cub结构域），这两个结构域在同一个细胞内部靠近后能够形成完整的泛素蛋白，泛素蛋白可以被泛素特异性蛋白酶（UBP，ubiquitin binding proteins; 该酶识别完整的泛素蛋白）识别。在膜蛋白互作酵母双杂交系统中，将一种目标蛋白（Prey蛋白：膜蛋白或细胞质蛋白）融合到泛素蛋白Nub结构域的C端（NubG/NubA，是将泛素分子被截断后的N端进行改造，从而降低Cub与Nub两者之间的亲和性，避免其发生自发重组现象）；将另外一种蛋白（bait蛋白：饵蛋白）连接到Cub结构域的N端，在Cub结构域的C端融合一个人工设计的转录因子蛋白（由细菌lexA的DNA结合结构域和单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域组成）。当两种蛋白相互结合时，Nub和Cub结构相互靠近，被泛素特异性蛋白酶识别，然后切割泛素融合蛋白，释放转录因子，转录因子进入细胞核后结合到特定的报告基因上游，进行报告基因的转录和表达。

█ 酵母双杂交技术（膜杂交系统）筛选流程

膜系统酵母双杂交技术-泰克生物2.png

图2 膜蛋白杂交酵母杂交系统流程图

泰克生物建立了基于酵母双杂交（膜系统）的膜蛋白互作验证平台、膜蛋白和胞质蛋白互作验证平台、酵母双杂交cDNA文库构建与筛选平台（可发现众多天然的、潜在的互作蛋白）。泰克生物构建的酵母双杂交cDNA文库/多肽文库的库容可达10^6-10^7，文库多样性、插入率均可达90%以上，满足各类客户对于酵母双杂交（膜系统）文库的质量要求。同时，泰克生物还能提供酵母双杂交（膜系统）文库构建与筛选的配套的下游表达验证和亲和力测定验证等一站式技术服务，客户只需要提供具体的靶蛋白序列信息、需要构建的文库种类以及样本信息，泰克生物的科学家均能够根据客户的需求进行合理的方案设计和个性化定制，助力客户的科研项目。

█ 酵母双杂交技术服务适样品要求

动物组织	单个样品>0.1g；样品尽量新鲜	-80℃保存
种子	单个样品>0.2g	-80℃保存
细胞	(1) total RNA：10^6cell/指标； (2) 浆/核RNA或蛋白：10^7 cell/指标 (3) 线粒体RNA或蛋白：2*10^7 cell/指标，样本尽量新鲜，细胞收取后直接加Trizol或直接冻存于-80℃ (4) 若细胞处理（加药、转染、感染）后状态差应酌情加大收样量	-80℃保存
全血	(1) 用抗凝管保存的外周血5~10ml，骨髓1~3ml；-80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μL，每400μL加入 400μLTrizol	-80℃保存
植物组织	单个样品>1g；尽量新鲜	-80℃保存

█ 酵母双杂交服务内容和周期

步骤

服务内容

周期

选择1：酵母双杂交文库构建

1) 总RNA提取（+mRNA纯化制备）

2) 高保真RT-PCR制备cDNA；cDNA第二链合成

3) 三框阅读框引物PCR+载体构建与转化：载体构建+初级文库鉴定（文库质粒扩增+测序与分析）

4) 次级酵母文库电转制备+文库鉴定文库质粒扩增+测序与分析）

5) 交付：酵母文库质粒1管（>500ug），酵母文库甘油菌10-20ml，实验报告

4-6周

选择2：酵母双杂交文库筛选

1) 诱饵质粒合成

2) 自激活验证+毒性验证+功能验证

3) 酵母筛选+复筛+阳性克隆测序+点对点验证

4) 交付：实验报告、测序原始数据

7-10周

█ 酵母双杂交术平服务优势

平台成熟，周期快

性价比高，实验结果有保证

文库库容大，多样性高

实验记录可追溯：文库QC质控标准，

原始实验记录

酵母双杂交（膜系统）服务常见问题解答

如何优化酵母双杂交膜系统的实验条件？

答：优化酵母双杂交膜系统的实验条件对于获得高效且可靠的结果至关重要。首先，选择合适的膜蛋白表达系统非常重要。酵母细胞的培养条件应根据实验目标进行优化，通常需要调节培养温度、培养基成分以及诱导条件，以确保膜蛋白的稳定表达和正确折叠。其次，选用适当的酵母菌株也是优化的关键，不同菌株对膜蛋白的表达和稳定性有不同的表现，因此需要根据实验需求选择最合适的菌株。此外，优化报告基因的表达和筛选系统也能提高实验的灵敏度和特异性。最后，实验中的对照设置也非常重要，阴性对照和阳性对照可以帮助排除非特异性信号和优化实验条件，确保数据的可靠性。
什么是酵母双杂交膜系统？其工作原理是什么？

答：酵母双杂交膜系统（Yeast Two-Hybrid Membrane System）是一种用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的高效方法。其基本原理是将两个不同的蛋白质分别与酵母细胞中两个不同的功能域融合，一个融合到DNA结合域（BD），另一个融合到激活域（AD）。在正常情况下，这两个蛋白质之间没有直接接触，因此激活域无法与DNA结合域配对，报告基因不会表达。然而，当这两个蛋白质在酵母细胞内相互作用时，激活域和DNA结合域接近并形成功能性复合物，启动报告基因的表达，从而指示蛋白质间的相互作用。膜系统的应用特别适合于研究膜蛋白的相互作用，能够有效模拟膜蛋白在天然细胞膜环境中的交互作用。
酵母双杂交膜系统的优势是什么？

答：酵母双杂交膜系统具有多项优势。首先，它能够在活细胞中模拟膜蛋白之间的天然相互作用，避免了传统体外重组系统无法复现膜蛋白在细胞膜上表现的特性。通过这种系统，研究人员可以更真实地评估膜蛋白间的相互作用。其次，酵母双杂交膜系统是一种高通量筛选方法，适合于大规模筛选潜在的蛋白-蛋白相互作用。它的灵敏度高，可以识别即使是低亲和力的相互作用。再者，酵母细胞易于操作和扩展，且系统经济实用，能够显著降低实验成本。最后，酵母双杂交膜系统不仅可以用于膜蛋白，还可以用于细胞质蛋白和细胞内其他组分的相互作用研究，具有广泛的适用性。
酵母双杂交膜系统与传统的酵母双杂交方法有何不同？

答：酵母双杂交膜系统与传统的酵母双杂交方法主要的区别在于目标蛋白的定位和相互作用的研究环境。传统的酵母双杂交技术通常用于研究溶解性蛋白质的相互作用，而酵母双杂交膜系统专注于研究膜蛋白之间的相互作用。膜蛋白的特殊性在于其嵌入细胞膜中，通常存在于膜的疏水区域，传统的酵母双杂交系统无法有效处理这种蛋白质的特性。膜系统通过将膜蛋白置于类似于天然细胞膜的环境中，使其能够保持正确的构象，增强了膜蛋白之间的相互作用识别能力。因此，酵母双杂交膜系统特别适合于研究膜蛋白的相互作用，包括受体、转运蛋白、信号传导蛋白等。
酵母双杂交膜系统在膜蛋白相互作用研究中的优势有哪些？

答：膜蛋白在细胞内发挥着至关重要的作用，然而，由于其疏水性质和膜内定位，膜蛋白之间的相互作用研究面临着许多挑战。酵母双杂交膜系统解决了这些问题，能够有效模拟膜蛋白在细胞膜环境中的相互作用。这一系统的优势包括首先能够在酵母细胞膜上重建膜蛋白的天然构象，提供了一个接近生理环境的模型。其次，酵母双杂交膜系统能够通过高通量筛选大规模的蛋白质相互作用，迅速识别功能相关的膜蛋白。最后，通过使用报告基因的检测方法，酵母双杂交膜系统可以非常灵敏地监测膜蛋白的相互作用，适合于早期筛选阶段，尤其对于药物开发和分子机制研究有重要价值。

如何优化酵母双杂交膜系统的实验条件？

答：优化酵母双杂交膜系统的实验条件对于获得高效且可靠的结果至关重要。首先，选择合适的膜蛋白表达系统非常重要。酵母细胞的培养条件应根据实验目标进行优化，通常需要调节培养温度、培养基成分以及诱导条件，以确保膜蛋白的稳定表达和正确折叠。其次，选用适当的酵母菌株也是优化的关键，不同菌株对膜蛋白的表达和稳定性有不同的表现，因此需要根据实验需求选择最合适的菌株。此外，优化报告基因的表达和筛选系统也能提高实验的灵敏度和特异性。最后，实验中的对照设置也非常重要，阴性对照和阳性对照可以帮助排除非特异性信号和优化实验条件，确保数据的可靠性。
什么是酵母双杂交膜系统？其工作原理是什么？

答：酵母双杂交膜系统（Yeast Two-Hybrid Membrane System）是一种用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的高效方法。其基本原理是将两个不同的蛋白质分别与酵母细胞中两个不同的功能域融合，一个融合到DNA结合域（BD），另一个融合到激活域（AD）。在正常情况下，这两个蛋白质之间没有直接接触，因此激活域无法与DNA结合域配对，报告基因不会表达。然而，当这两个蛋白质在酵母细胞内相互作用时，激活域和DNA结合域接近并形成功能性复合物，启动报告基因的表达，从而指示蛋白质间的相互作用。膜系统的应用特别适合于研究膜蛋白的相互作用，能够有效模拟膜蛋白在天然细胞膜环境中的交互作用。
酵母双杂交膜系统的优势是什么？

答：酵母双杂交膜系统具有多项优势。首先，它能够在活细胞中模拟膜蛋白之间的天然相互作用，避免了传统体外重组系统无法复现膜蛋白在细胞膜上表现的特性。通过这种系统，研究人员可以更真实地评估膜蛋白间的相互作用。其次，酵母双杂交膜系统是一种高通量筛选方法，适合于大规模筛选潜在的蛋白-蛋白相互作用。它的灵敏度高，可以识别即使是低亲和力的相互作用。再者，酵母细胞易于操作和扩展，且系统经济实用，能够显著降低实验成本。最后，酵母双杂交膜系统不仅可以用于膜蛋白，还可以用于细胞质蛋白和细胞内其他组分的相互作用研究，具有广泛的适用性。
酵母双杂交膜系统与传统的酵母双杂交方法有何不同？

答：酵母双杂交膜系统与传统的酵母双杂交方法主要的区别在于目标蛋白的定位和相互作用的研究环境。传统的酵母双杂交技术通常用于研究溶解性蛋白质的相互作用，而酵母双杂交膜系统专注于研究膜蛋白之间的相互作用。膜蛋白的特殊性在于其嵌入细胞膜中，通常存在于膜的疏水区域，传统的酵母双杂交系统无法有效处理这种蛋白质的特性。膜系统通过将膜蛋白置于类似于天然细胞膜的环境中，使其能够保持正确的构象，增强了膜蛋白之间的相互作用识别能力。因此，酵母双杂交膜系统特别适合于研究膜蛋白的相互作用，包括受体、转运蛋白、信号传导蛋白等。
酵母双杂交膜系统在膜蛋白相互作用研究中的优势有哪些？

答：膜蛋白在细胞内发挥着至关重要的作用，然而，由于其疏水性质和膜内定位，膜蛋白之间的相互作用研究面临着许多挑战。酵母双杂交膜系统解决了这些问题，能够有效模拟膜蛋白在细胞膜环境中的相互作用。这一系统的优势包括首先能够在酵母细胞膜上重建膜蛋白的天然构象，提供了一个接近生理环境的模型。其次，酵母双杂交膜系统能够通过高通量筛选大规模的蛋白质相互作用，迅速识别功能相关的膜蛋白。最后，通过使用报告基因的检测方法，酵母双杂交膜系统可以非常灵敏地监测膜蛋白的相互作用，适合于早期筛选阶段，尤其对于药物开发和分子机制研究有重要价值。

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