核酸适配体文库筛选技术介绍-分子生物学服务专题-泰克生物-酵母展示服务专家

核酸适配体文库筛选技术介绍

核酸适体是通过一种称为配体指数富集系统进化(SELEX)的体外方法筛选的寡核苷酸序列。适体被称为“化学抗体”，可以通过高亲和力的构象变化实现对靶标的特异性识别，具有化学合成制备简单、成本低廉、相对稳定、批次间可变性低、易于修饰和信号扩增、免疫原性低等吸引人的特点。目前，适体在疾病诊断、环境检测、食品安全、药物传递和发现等方面显示出巨大的应用潜力和经济效益，吸引了超过许多学科研究者的关注。

一．核酸适配体筛选

文库包含一个随机区域，两端有两个固定的引物结合序列，以便通过PCR扩增富集序列。理想情况下，开发的适体序列应该通过仅由随机区域的核苷酸形成的三级结构结合它们的靶标。然而，在SELEX过程中，固定引物结合位点与随机区域序列之间的相互作用是不可避免的。有研究表明，引物结合位点参与了适配体功能二级结构的形成。结构利用恒定引物结合区域的功能基序可能在富集库中更普遍，并在遗传中占主导地位。

作为SELEX的重要组成部分，PCR扩增始于引物与固定引物结合位点的结合。具有随机区域的序列与固定的引物结合位点表现出强相互作用（竞争引物与引物结合位点的结合），可能在引物结合和随后的扩增中表现出选择性劣势。经过多轮选择和扩增，这种选择劣势很可能超过由随机区域形成的功能基序的任何选择优势。相反，具有随机区域的序列不显示与固定引物结合位点的相互作用。

像蛋白质一样，适配体需要一个二级结构来结合它们的目标。据报道，有4n（等于碱基的数量）种类的寡核苷酸，一个经典的NA文库包含多达10^15个序列，构成了一个巨大的、高度多样化的适配体选择文库。有了这样的文库，人们可以期望适配体可以是瞄准任何你能想到的目标。不幸的是，SELEX的成功率仅为30%，被文库中显示简单结构主题和不稳定支柱的许多序列所混淆，这两种方法都不太可能形成高质量的适配体。通过引入设计的模式，有利于信息丰富的结构随机区域功能二级结构的出现可以显著增加，是设计高效SELEX库的实用方法。

核酸适配体筛选过程-泰克生物.png

图1 核酸适配体筛选过程

二．适配体筛选方法汇总

方法	优势	缺点
在无基质条件下硝化纤维素膜过滤下培养目标和库	-- 易操作	-- 仅适用于蛋白质（取决于膜大小不能结合小肽）； -- 由于核酸与膜的非特异性结合，效率低；
电泳迁移率转移试验	-- 处理简单； -- 可进入常规实验室； -- 启用实时监控选择过程； -- 最小化非特异性结合；	-- 只适用于蛋白质目标； -- 由于采用天然凝胶电泳，分辨率较低； -- 难以保持稳定的选择条件，如温度，盐浓度；
毛细管电泳系统	-- 高分离分辨率，支持单轮选择； -- 适用于广泛的靶标，特别是小分子； -- 通过操纵分离参数开发具有预定义属性(Kd, koff, kon)的智能适配体； -- 最小化非特异性结合；	-- 相对有限的库输入； -- 难以优化某些蛋白质的分离条件；
固相固定目标	-- 简单处理； -- 适用于广泛的目标； -- 可进入常规实验室； -- 启用实时监控选择过程；	-- 与固定基质非特异性结合； -- 采用的固定靶标的方法会影响靶标的天然结构；
用盐、脱氧核糖核酸酶等洗脱具有优选性质的序列	-- 简单而廉价； -- 开发具有首选结合特性的适配体；	其可靠性有待进一步研究
固相捕获上的固定库序列SELEX	-- 适用于针对无法固定的小分子开发适配体 -- 最小化非特异性绑定和选择回合 -- 选择进行结构转换的适体 -- 最小化非特异性结合 -- 单轮适配体选择 -- 候选适体可以通过原子力显微镜(AFM)和AFM尖端进行物理识别和收集	-- 只有经过结构转换的适体才能被开发 -- 通过对接序列引入额外的变化

三．通过截断和定点诱变获得短的适配体序列

SELEX过程产生的适体长度通常为60-100nt，在每个末端包含25-50nt的随即区域和固定的引物结合区。固定引物结合序列对适体的结合特性没有贡献。因此，在序列数据分析时，通常会删除引物结合位点，只留下随机区域进行结合研究。通过对发育的适体进行结构分析，可以进一步缩短适体的随机序列区。适配体与标靶的结合特性主要是由更复杂和信息丰富的结构贡献，例如G-四联体、三/五向结构和发夹结构等。在许多情况下，截短的序列与亲本适配体序列相比，确实保持了相同的或更好的结合亲和力和标靶特异性。

泰克生物提供的适体体外筛选服务可以为客户快速、准确的筛选出具有高亲和力、高特异性的适配体，为客户的实验项目节省成本。我们通过指数富集 (SELEX) 方法灵活利用配体系统的自然进化（比如：SELEX法可以识别不同的细胞或检测两类细胞的分子水平差异），提供一站式体外适配体筛选服务。

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