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抗体噬菌体展示与酵母展示的本质区别?

1.什么酵母展示平台

酵母展示是指外源蛋白质/肽通过连接或锚定至酵母细胞壁组合物而在细胞表面表达。为了实现这一点,外源基因与细胞壁蛋白基因融合,其中 Aga2p 最常用于抗体展示。Aga2p 属于负责融合事件的酵母凝集素蛋白家族,通过 Aga1p 上的两个二硫键固定在细胞表面。利用Aga2p作为融合蛋白的优点之一是其距离细胞壁较远,因此融合的抗体在空间上更加灵活,避免了由于空间位阻而导致的活性损失。另一个优点是,Aga2p 在细胞生长后在 GAL1 启动子的控制下表达,保护酵母细胞免受潜在有毒抗体的侵害,从而确保文库中所有抗体的展示。然后用抗原包被的磁珠对展示有抗体或其他蛋白质的酵母进行筛选,然后进行几轮 FACS 筛选具有所需特性的抗体/蛋白质。

 

酵母文库展示示意图-泰克生物1.jpeg 

图1:酵母文库展示示意图

2.什么噬菌体展示

噬菌体是一类由外壳蛋白包裹DNA或RNA的病毒。它们可以感染作为宿主的细菌,将其基因插入细菌基因组中,并产生外壳蛋白和基因以在细胞质中重组噬菌体颗粒,然后分泌到周质中。转化细菌后能够产生噬菌体的质粒称为噬菌粒。当外源基因插入噬菌粒并转化为细菌时,就会产生衣壳上展示有外源蛋白/肽的噬菌体。

噬菌体展示技术-泰克生物2.png 

图2:噬菌体展示技术

 

3.酵母展示和噬菌体展示有什么区别?

酵母展示在某些方面比噬菌体展示有优势,但也有一些缺点。

(1) 在筛选/淘选步骤中,酵母展示适用于 FACS,可以精确筛选出具有所需结合特性的抗体。然而,噬菌体展示中抗体与抗原的亲和力只能通过调整洗涤缓冲液成分来粗略分层。

(2)由于其真核表达系统,酵母展示的抗体可以被正确折叠和修饰,例如糖基化,与大肠杆菌在噬菌体展示中表达的抗体相比,更接近其在哺乳动物中的天然结构。

(3)由于酵母的转化效率较低,酵母展示的抗体多样性可能低于噬菌体(酵母为107-109 ,噬菌体最多为1011 )。

(4)由于酵母表面上的抗体拷贝数(104-105)比噬菌体多得多,因此可以利用酵母展示系统根据抗体亲合力筛选出低亲和力抗体。 

 

4.泰克生物能够为客户提供高质量的噬菌体文库构建服务

M13单链丝状噬菌体展示系统是目前应用较广泛的文库展示系统,通过将蛋白、抗体或多肽与噬菌体pIII蛋白融合表达,使之参与噬菌体组装,并展示在噬菌体表面,形成噬菌体展示文库,泰克生物利用M13丝状噬菌体壳蛋白pIII和PVIII展示技术,能够为客户构建不同物种的天然或者免疫的噬菌体抗体展示文库,通过抗体库技术制备多物种单克隆抗体,如人,鼠,兔,鸡,羊,鹅,猪,牛,马,驴,骆驼,羊驼,鲨鱼等物种来源的单克隆抗体,可根据客户的需求提供定制服务,并且库容量可达1011

 

5.泰克生物为客户提供噬菌体文库构建服务的全流程介绍

泰克生物为客户提供噬菌体文库构建服务,流程包括:总RNA提取,反转录获取cDNA,PCR扩增,载体与 PCR 产物酶切连接,细菌文库构建,噬菌体文库构建,噬菌体文库效价检测。

噬菌体展示抗体库构建流程-泰克生物3.jpeg 

图3:噬菌体展示抗体库构建流程

5.1总RNA提取

将外周血淋巴细胞从冰箱取出后分装,加入氯仿,离心后取上清加入异丙醇,离心保留沉淀,加入75%乙醇后离心保留沉淀,干燥后加入DEPC水,孵育确保RNA溶解,将各管混合到一管中即为总RNA,取1μl总RNA进行电泳,取2μl用核酸浓度测量仪测浓度。

 VHH RNA提取-泰克生物4.png

图4:VHH RNA提取

5.2反转录获取cDNA

按照商业化试剂盒操作说明书进行cDNA制备,将上一步得到的RNA一分为二反转录成cDNA,反转录引物分别用Oligo dTprimer及random 6-mers。

 

5.3PCR扩增

5.3.1第一轮PCR

以 cDNA 为模板进行第一轮PCR反应,使用HS Ex Taq酶进行PCR扩增。PCR反应体系为:

 

试剂

使用量

cDNA

0.5-5μl

AlpVh-L/CALL 002

2μl/2μl

dNTP Mix

4μl

10×ExTaq Buffer

5μl

HS Ex Taq

0.25μl

ddH2O

Up to 50μl

 

将得到的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,找到目的条带进行上述条件PCR扩增,将所有PCR产区进行1%琼脂糖凝胶电泳,使用通用型DNA纯化回收试剂盒对切胶的胶条进行DNA回收。

第一轮PCR扩增结果-泰克生物5.jpeg 

图5:第一轮PCR扩增结果

 

5.3.2 第二轮PCR

以上一步PCR扩增并回收后的DNA片段作为模板再次扩增特定的抗体片段,PCR 反应体系为:

 

试剂

使用量

第一轮 PCR 回收产物

0.1-2μl

Rvhh FP/RvhhRP

2μl/2μl

dNTP Mix

4μl

10×ExTaq Buffer

5μl

HS Ex Taq

0.25μl

ddH2O

Up to 50μl

 

将得到的PCR扩增产物使用DNA纯化回收试剂盒按说明书回收。

第二轮PCR扩增结果-泰克生物6.jpeg 

图6:第二轮PCR扩增结果

5.4载体与PCR产物酶切连接

第二轮PCR产物通过酶切连接到噬菌体质粒pADL-10b中,从而构建含有扩增片段的噬菌体质粒库。将连接产物使用DNA纯化回收试剂盒按说明书回收,分别取2μl用核酸浓度测量仪检测回收产物的浓度。

5.5细菌文库构建

将连接产物进行电击转化后构建含有目的抗体片段的大肠杆菌文库。

取SS320大肠杆菌感受态细胞,加入回收后的连接产物,将混合后的感受态细胞和连接产物转移到预冷好的电转杯中,使用电转仪预设的转化程序电击转化,电转后立即往电转杯中加入950μlSOC培养基,至少进行20个电转。将细胞复苏后涂在含有氨苄抗性的琼脂糖培养板上过夜生长。将上一步过夜生长后的培养板上的细胞用2xYT培养基和涂布棒冲洗刮下,加入20%的甘油测OD600nm值后保存在-80℃,即为细菌文库。

 

VHH阳性率-泰克生物7.jpeg 

图7:VHH阳性率:>90%

5.6噬菌体文库构建

5.6.1噬菌体文库扩增

将上一步刮下的菌体混匀后转移到100 mL预先加入四环素的2x YT培养液中,37℃,250rpm培养直至OD600nm达到0.5-0.55。

按照辅助噬菌体:细菌细胞数目为20:1的比例加入辅助噬菌体后继续37℃培养30分钟。加入终浓度为50μg/mL的Kana和终浓度为0.2mMI PTG,30℃过夜摇床培养。

5.6.2噬菌体文库制备

将过夜培养的细菌4℃ 4000 rpm离心20分钟,将上清转移到新的离心管后加入1/4体积预冷的的20%PEG/2.5M NaCl,在冰上孵育30分钟。4℃ 4000 rpm离心20分钟去除上清后加入1 mL PBS缓冲液溶解沉淀。再次加入1/4 体积预冷的20%PEG/2.5M NaCl后冰上孵育10分钟,4℃ 12000 xg离心10分钟后去除上清并将沉淀溶解在1 mL PBS中得到噬菌体库,长期-80℃保存,短期(1-2周)可于4℃放置保存。

5.7噬菌体文库效价检测

将-80℃冰箱保存的 SS320 菌株培养后,从单菌落板上挑取一个单菌落到 5ml  2×YT 培养基过夜培养,过夜培养菌液OD600 为 0.5-0.55。取制备好的噬菌体文库稀释12个梯度,每个梯度加入90μl 的 SS320 菌液培养,每个稀释管取5μl加到2×YT 固体培养基(Amp)过夜培养,即可计算效价。


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