酵母双杂交实验常见问题及解决方案-酵母展示技术专题-泰克生物-酵母展示服务专家

酵母双杂交实验常见问题及解决方案

1.某些蛋白质可能由于其序列特点而难以进行双杂交分析如何处理？

答：

酵母双杂交技术对蛋白质序列具有一定的选择性，这可能导致无法检测到某些相互作用。为了克服这个问题，可以考虑使用其他相衔接的实验方法，如共沉淀实验证实相互作用。

2.GAL4双杂系统常用质粒有什么？

答：

常用的载体为pGBKT7和pGADT7。两种载体均为穿梭载体，同时包含大肠杆菌和酵母菌的复制起始位点，并含有不同的抗性以及氨基酸缺陷型筛选标记。

3.酵母双杂交的主要用途有哪些？

答：

发现与已知蛋白互作的蛋白（通常利用筛库来实现）；确认两个蛋白之间的相互作用；鉴定参与蛋白相互作用的区域。

4.常用自激活检测的报告基因有哪些？

答：

诱饵的自激活，是通过报告基因的表达来检测的。双杂报告基因包含HIS3，ADE2，MEL1，lacZ以及AbAr，理论上所有的报告基因都可以用于自激活检测。但常用双杂自激活检测的报告基因只有AbAr+MEL1组合或者HIS3。现有实验技术，AbAr和HIS3产生的自激活更容易获得相应的抑制剂。

5.酵母双杂交实验出现假阴性如何处理？

答：

如果实验结果发现，原本已知有相互作用的蛋白质，在实验时未检测出来，那么可能是由于蛋白质折叠或局部结构不完整、表达量过低、转录激活因子缺失等因素引起的。使用不同条件下的培养基、优化蛋白质表达水平、选择合适的培养时间和温度等方法可能能够解决该问题。

6.酵母双杂交实验出现假阳性如何处理？

答：

假阳性结果可能是由于非特定或无关的蛋白质相互作用导致的。为了减少假阳性结果，可以采取一系列对策，如增加阴性对照组、使用多个蛋白质标签、进行序列分析和功能验证等。

7.获得的阳性克隆，PCR检测有多条片段怎么办？

答：

可能是由于一个酵母细胞可以包含多个捕获蛋白。可以尝试选取单克隆划板2-3次，进行蓝白斑筛选，直到没有分离，找到阳性克隆，用于后续实验。

8.筛选培养基上克隆太多怎么办？

答：

可能诱饵蛋白存在自激活，自身就可以激活下游筛选标记的表达；或者是筛选条件过于宽松。可以选用更为严格的筛选条件抑制诱饵蛋白的自激活活性，如果效果不理想，可以删除诱饵蛋白能够引起自激活活性的结构域，再用于酵母双杂交实验。