核酸适配体的筛选与优化-分子生物学服务专题-泰克生物-酵母展示服务专家

核酸适配体的筛选与优化

核酸适配体的介绍

单克隆抗体生产技术于1975年，不仅可用于基础科学，还可用于药物、生物传感器等领域，在医学上具有重大意义。世界上首例治疗型抗体发现于1986年，用于预防肾移植排斥反应，此后，许多抗体药物发现可以用于治疗各种疾病，比如哮喘。但单克隆术在治疗疾病时具有一定的局限性。例如，针对脂质、碳水化合物和有机大分子的抗体亲和力较低，与药物偶联的亲和力受到一定的影响。因此，人工配体-适体逐渐兴起。

适配体（aptamers）是一类能够与特定靶标分子高度结合的单链核酸（DNA或RNA）分子，其独特的结构和性质使其在生物医学研究和应用中逐渐成为一项重要技术。与传统的抗体相比，适配体具有体积小、合成成本低、均一性高、易于定制修饰等一系列显著优势。由于适配体是由短链核酸构成，它们的合成不依赖于细胞培养，可以通过化学合成的方式快速大规模生产，这使得适配体在商业化生产中更具优势。

适配体与靶标的结合通常依赖于其独特的三维结构，可以针对特定的小分子、离子、蛋白质、病毒或其他生物分子进行高效识别和结合。这些特性使得适配体能够广泛应用于各种领域，如靶向药物递送、临床诊断、环境监测、食品安全等。在靶标范围的扩展上，适配体特别适用于那些传统抗体无法有效识别的小分子和金属离子，这在一些特殊的应用场景中极为重要。此外，适配体具有较强的可定制性，研究人员可以通过精确的化学修饰来增强其稳定性、亲和力和选择性。这种定制能力使得适配体可以为不同的实验需求提供定制化的解决方案。在核酸模板的基础上进行的优化和修饰为适配体在精准医疗和药物开发中的应用提供了广阔的前景。

核酸适配体（aptamers）是一类具有高度特异性的小分子配体，由20至110个核苷酸构成，通常以单链DNA或RNA的形式存在。其基本结构包括两部分：一部分是固定序列，另一部分则是随机序列。随机序列通过在一个特定范围内的变异，形成具有不同空间结构的核酸片段，这些片段在经过筛选后能与目标分子（如蛋白质、离子、小分子等）结合。核酸适配体的设计和筛选过程通常依赖于称为SELEX（系统进化的体外配体选择）的方法，通过多轮选择，逐步筛选出那些能够高效、特异性结合目标分子的适配体。

适配体的独特性质在于其能够通过折叠形成特定的三级结构，这种结构通常是由核苷酸序列之间的氢键、π-π相互作用和其他非共价键相互作用所决定的。这些结构不仅使适配体具备高度的结合亲和力，而且能够非常精确地识别和结合靶标分子。核酸适配体的这种“分子识别”能力和抗体相似，但在分子量、生产方式、合成成本以及可修饰性等方面具有独特优势。

由于其小分子量和高度的灵活性，核酸适配体能够与各种靶标分子进行结合，不仅包括大分子蛋白质，也包括小分子药物、金属离子甚至是病毒等病原体。此外，适配体的设计能够精确调控其亲和力、稳定性及选择性，因而可以根据不同的需求进行优化。这些优势使得核酸适配体在许多领域中展现出广泛的应用潜力，尤其是在精准医学、疾病诊断、药物递送和生物传感器等领域。例如，适配体可以通过精准的结构设计和修饰，实现对复杂病理环境中靶分子的特异性识别与结合，这使得它们在靶向治疗中具有重要意义。在药物开发过程中，适配体不仅能够作为替代抗体的靶向配体，还能用于筛选新药物、开发新型生物标志物和传感器，甚至用于疫苗研发领域。

核酸适配体优点：①具有热稳定性高、便于化学合成与修饰、免疫原性低等优点，应用于生物分析、生物医学、生物技术、传感技术等领域。②具有生产时间短、成本低、特异性高等优点，应用于医学领域。

核酸适配体缺点：筛选费时费力、失败率高、成本高。

适体体外筛选与优化

1.快速筛选方法

快速筛选方法在核酸适配体的开发过程中具有至关重要的作用，能够显著提高靶标与适配体的结合效率，减少筛选轮次，从而加速研究进程。其中，基于电泳（CE）、微流控芯片和磁珠的SELEX技术是目前应用最广泛且影响力最强的快速筛选方法。

①、CE-SELEX（Capillary Electrophoresis-SELEX）是一种结合电泳技术的筛选方法，通过高效分离适配体和靶标复合物，仅需要1到3个筛选循环即可快速获得高亲和力的适配体。该方法通常用于蛋白质靶标的核酸适配体筛选，以其快速、高效的特点广泛应用于生物医药领域。

②、微流控芯片技术（M-SELEX）为核酸适配体的快速筛选提供了更为紧凑和高效的解决方案。该方法依托微流控技术，能够实现更高的自动化、微型化和集成化，使得筛选过程不仅加速，而且可以进行大规模、高通量的筛选。这为精准筛选和优化适配体提供了新的可能，尤其在药物研发和生物传感领域显示出巨大的潜力。

③、磁珠-SELEX（MB-SELEX）是一种将靶标通过化学方法固定在功能化磁珠上的筛选方式。通过磁场将结合了靶标的适配体从未结合的序列中分离出来。这一方法在分离效率上较为依赖实验条件，虽然可以较为快速地筛选出适配体，但整体筛选效率较低，因此在需要高效率筛选时可能存在一些局限性。

这些快速筛选技术不仅提高了适配体筛选的效率，还为后续的高通量筛选和精准优化提供了更灵活的选择方案，为核酸适配体的应用与发展奠定了基础。

2.适合小分子靶标核酸适配体筛选的方法

随着适配体筛选技术的不断发展，基于靶标固定的体外筛选方法已有效解决了文库非特异性结合、靶标结合位点暴露、亲和力较低以及化学修饰等一系列技术难题，显著提高了适配体筛选的准确性和效率。

Capture SELEX（基于文库固定的筛选技术）便是突破这些技术瓶颈的代表性方法。该方法采用的适配体文库由三部分组成：随机序列、对接序列和引物序列。在筛选过程中，适配体文库通过特定的对接序列与靶标结合，从而有效避免了非特异性结合的问题，同时也保证了靶标结合位点的暴露，提高了筛选出的适配体的亲和力和特异性。这一技术的应用，极大提升了筛选效率和结果的可靠性，使得适配体的筛选过程更加精准。

另一方面，均相筛选技术通过简化筛选步骤，进一步提高了适配体筛选的效率。这种技术能够快速从大量文库中筛选出与靶标具有高度亲和力的核酸适配体，并且所筛选出的适配体不仅可以用于基础研究，还能够转化为生物传感器，用于环境监测、医疗检测等多个领域。均相筛选通过减少了操作复杂性，使得筛选过程更高效、灵活，极大地推动了适配体技术的应用普及。

3.体内高稳定性核酸适配体的筛选

化学修饰是提高适配体在体内稳定性的关键技术之一。从最初的对磷酸骨架、戊糖和碱基进行修饰，到引入人工碱基，化学修饰已成为提升适配体稳定性的常用方法。这些化学修饰能够有效增强适配体的生物稳定性，延长其在体内的半衰期。通过这些修饰，适配体能够抵抗体内外的酶降解，从而提高其作为药物递送工具或诊断试剂的应用潜力。

在筛选过程中，可以直接使用经过化学修饰的适配体文库进行筛选，也可以对包含天然碱基的文库进行筛选，以寻找最优的适配体。这使得研究人员能够根据需求选择合适的筛选策略。

镜像核酸适配体（L型核酸）是一种特殊的核酸形式，它与天然的D型核酸结构相反，因此不容易被天然的核酸酶降解。由于其高度的化学稳定性，镜像核酸适配体在体内具有较长的生物半衰期，并在药物递送和生物传感器等领域展现出巨大的应用潜力。

环状核酸（CNA）是一种通过连接核酸的两端形成环状结构的分子，这种结构能够有效抵抗核酸外切酶的降解，具有极高的稳定性。环状核酸广泛应用于基于滚轮扩增的生物传感器中，由于其独特的稳定性和耐酶降解特性，CNA在生物检测和精准医疗中具有重要的应用价值。

4.提高核酸适配体特异性的筛选方法

目前，适配体筛选主要采用两种方法。一种是通过负筛选，这种方法虽然能够有效去除非特异性结合的分子，但通常会受到背景干扰和高交叉反应的影响，导致筛选结果的准确性受到一定限制。另一种方法是联用2-3种SELEX技术，通过结合不同的筛选策略，可以有效消除单一SELEX技术可能引入的非特异性序列，从而提高筛选结果的精确性和可靠性。这种多重筛选策略能够在多个筛选环节中进一步优化适配体的特异性和亲和力，确保获得高质量的适配体。

5.提高核酸适配体亲和力的筛选方法

常规的提高适配体亲和力的筛选方法包括降低正筛靶标浓度、使用化学修饰文库、提高筛选压力进行筛选，随着技术的发展，工程化设计或者体外筛选高价的核酸适配体成为提高核酸适配体的一种技术手段。

肽适体筛选

肽适体筛选方法的选择取决于肽适体的后续实验用途，可分为体内非显示系统、体外显示系统和基于生物信息学的新兴分子对接模拟方法。

①、酵母双杂交技术

随着技术的发展，已将Y2H系统与下一代测序(NGS)集成，创建了Y2H-seq测定方法，该方法仅需要一步PCR就能全面鉴定相互作用蛋白，显著提高了实验效率。

②、噬菌体展示技术

该技术在整个筛选过程中，可以保存肽适体的活性，竞争环境促进了对筛选的肽适体的亲和力的提高。但在处理固相上的小分子靶标时，需要进行耗时的反向筛选。

③、分子对接技术

分子对接是一种模拟技术，用于预测受体和配体的结合方式（包括对接位置、对接大小、结合亲和力等），与生物信息学结合可以设计和筛选肽适体。

泰克生物提供专业的核酸适配体筛选服务，致力于为客户筛选出具有高亲和力和高特异性的核酸适配体。通过先进的SELEX技术，结合负筛选、联合筛选和多轮优化策略，泰克生物能够有效消除非特异性结合并确保筛选结果的准确性。此外，泰克生物还提供化学修饰、稳定性优化等服务，帮助客户获得高稳定性和高效性的适配体，满足各种生物医药和诊断应用的需求。