纳米抗体开发服务-泰克生物-酵母展示服务专家

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纳米抗体开发服务

泰克生物为客户提供基于M13噬菌体抗体展示系统的高亲和力、高特异性的抗体药物前期发现技术服务，为客户后续的CAR-T/CAR-NK先导序列设计、抗体人源化、药物靶点抗体开发、双特异性抗体开发以及高效阻断型中和抗体开发等下游研发工作提供有力支持。泰克生物在药物抗体发现方面拥有10年的项目开发经验和心得，能够为客户提供高质量的针对包括但不限于蛋白、多肽、小分子、病毒、膜蛋白等靶点的驼源VHH纳米抗体开发服务。

█ 纳米抗体开发技术服务

泰克生物可为客户提供驼源VHH纳米抗体文库构建以及筛选服务。本技术平台使用M13噬菌体，将来自驼源的VHH纳米抗体基因通过多轮PCR方法插入到M13噬菌体的P3蛋白的N端，使纳米抗体基因随外壳蛋白的表达而展示到噬菌体表面，最后通过类似于“钓鱼”的淘筛方式筛选出跟靶点抗原结合的抗体。泰克生物能够为客户提供高质量的羊驼/骆驼免疫服务，基于噬菌体展示技术的纳米抗体文库构建以及淘筛服务（免疫文库库容为10^9-10^10（天然文库库容为10^10-10^12），文库多样性>90%、插入率95%、阳性率>95%）。相较于传统杂交瘤方法，噬菌体展示技术属于高通量方法：前者融合效率一般<0.4%，即1000次融合细胞中，大概4个融合子杂交瘤细胞；而噬菌体展示轻松可以获得10^8-10^9个正确且不同序列的抗体，并且每一步都可以随意暂停或启动实验，属于模块化实验操作，节省时间以及开发成本。目前被广泛应用于CAR-T/CAR-NK治疗性的驼源VHH抗体（又被称为纳米抗体）噬菌体展示发现路径如图1所示：

VHH纳米抗体发现服务流程-泰克生物.png

图1基于噬菌体技术平台的VHH纳米抗体发现服务流程

█ 纳米抗体开发服务内容和周期

步骤	服务内容	QC检测	周期
Step1：抗原准备	*抗原类型： (1) 重组蛋白制备 (2) 小分子（改造）+偶联 (3) 多肽合成+偶联 (4) 客户提供灭活病毒 (5) 客户提供封装好的mRNA	（1）重组蛋白(纯度>85%)；（2）小分子纯度>90%；（3）多肽纯度>90%；	4-6周
Step2:动物免疫	(1) 动物免疫4次，加强免疫一针，共计免疫5针； (2) 免疫前采集阴性血清，第4针采血进行ELISA检测血清效价； (3) 若第4针血清抗体效价满足要求，则采血前7天再次加强免疫1针，如不满足要求，则继续常规免疫； (4) 效价合格，采血分离单核细胞；	（1）动物：背景清晰；（2）免疫：蛋白/病毒抗原效价检测；多肽/小分子抗原效价检测；	8-10周
Step3:模板cDNA制备	(1) PBMC总RNA提取 (2) 高保真RT-PCR制备cDNA	（1）PBMC细胞质控；（2）Total RNA质控；（3）cDNA质控；	1 天
Step4:噬菌体展示文库构建	(1) 以cDNA为模板，PCR法扩增VHH基因； (2) 噬粒构建与转化： VHH基因拼接噬菌粒载体，电击转化TG1宿主菌，构建抗体库； (3) 鉴定：随机挑选克隆，PCR鉴定阳性率+插入率 (4) 辅助噬菌体准备：M13噬菌体扩增+纯化； (5) VHH展示文库救援	（1）文库阳性率检测；（2）文库插入性率检测；（3）库容检测+序列检测	2-3周
Step5:文库筛选	(1) 抗原包被（单个蛋白筛选，常规默认是固相筛选法或磁珠分选）； (2) 默认3-5轮筛选：压力筛选，最大限度去除非特异性抗体； (3) 挑取单个克隆扩增噬菌体+诱导表达+ELISA检测阳性克隆； (4) 挑取全部阳性克隆进行基因测序；	（1）ELISA阳性标准设定；（2）VHH筛选标准设定	2-3周
Step6:成药性评价	(1) 将获得的抗体序列构建合适的表达载体进行表达+亲和纯化+抗体蛋白定量； (2) ELISA验证抗体与抗原结合; (3) BLI法验证抗体亲和力； (4) 细胞功能验证：流式阻断验证；	（1）重组抗体表达质控；（2）EC50 验证（3）快速亲和力测定结果；（4）阻断验证结果；	4-6周

泰克生物为客户进行初步成药性评价后，还能提供抗体人源化、抗体亲和力成熟、CAR-T/CAR-NK先导序列设计及细胞杀伤验证等一站式技术服务，根据客户的需求进行合理的方案设计和个性化定制，为客户的科研项目及药物抗体开发助力。

█ 纳米抗体开发服务优势


拥有免疫基地，多种驼源免疫可供选择，包括但不限于大羊驼llama、小羊驼Alpaca以及骆驼等，且动物来源背景清晰	多种抗体库噬菌体展示可选：VHH抗体库展示、scFv抗体库展示等	多种靶点抗体发现服务可选：蛋白、多肽、小分子、病毒、膜蛋白、 mRNA等	文库库容大：免疫文库库容10^9-10^10，天然文库库容10^10-10^12

文库筛选方式灵活：固相筛选、液相筛选、细胞筛选、磁珠筛选等	实验记录可追溯：QC质控标准（免疫效价、PBMC质控、文库质控及筛选验证质控），中英文实验报告，原始实验记录	一对一个性化方案定制（包括免疫方案、建库方案、筛选方案以及后续的体外表达验证方案等），满足各类客户的科研项目需求	可提供一系列配套的下游药物抗体开发服务，抗体体外表达验证、抗体人源化、抗体亲和力成熟、双特异性抗体开发、CAR-T先导序列分子设计等

纳米抗体开发服务常见问题解答

什么是VHH抗体？

答：VHH抗体是研究人员发现的一种缺失VL的抗体，它的结构简单，仅由两条VH组成。纳米抗体是VHH组成的，那个易于识别和运送。之后，人们在羊驼和鲨鱼等其他动物中也发现了这种结构的抗体。虽然没有VL结构域，但仍然能够与抗原结合，是具有高度稳定性的单结构域抗体。泰克生物可以通过为客户提供包括文库构建和筛选，VHH纳米抗体构建等一系列服务，通过纳米抗体合成以及噬菌体展示开发平台，能够高效构建并筛选包括多种不同类型的噬菌体抗体文库，为我们的顾客提供专一的、高特异性的抗体解决方案。
VHH抗体发现服务包含哪些主要环节？

答：首先，泰克生物选择健康、无疾病的羊驼进行免疫，刺激其产生反应，这些动物能够产生单域抗体。从PBMC中分离单B细胞，抽提RNA，再逆转录成cDNA。最后将其做为模板，并通过凝胶电泳筛选目标VHH序列。对筛选得到的VHH抗体序列进行测序分析然后进行VHH抗体序列设计。通过引入某些特定突变进行筛选等方法，泰克生物获得更高稳定性VHH抗体突变体。然后将筛选得到的VHH序列插入适当的表达载体中（如质粒、病毒等），进行VHH抗体表达。最后通过噬菌体展示技术，让VHH抗体表达在噬菌体表面，然后利用筛选出能够反应的纳米抗体。泰克生物对其进行测序和验证，确保序列的正确性和功能活性。
VHH抗体发现服务的优势

答：VHH技术利用了基因工程中的大量进步，使得基因被常规地剪接在一起并重排，以提供具有上级结合力的工具，该工具易于纯化，同时还包含标记标签。利用高通量技术，可以在短时间内从大量候选抗体中选出具有特定功能的VHH抗体。VHH可以无限量\经济地生产，当暴露于热和溶剂时更稳定，并且可以进行基因操作以用于无数的用途，包括支架、标记和改变特定氨基酸。VHH适用于电化学生物传感器和装置等。我们推测结合结构域的更高密度将在增加的信号和因此更高的灵敏度方面提供突出的优势。VHH抗体在诊断和治疗、中枢神经系统疾病治疗等利用频繁。VHH 抗体对于监测食品和饲料中的霉菌毒素特别有用，因为它们很容易进行基因工程改造并且具有优异的稳定性。
VHH抗体发现服务我们如何进行免疫原的选择？

答：在免疫应答的进程中，我们采用了多样化的免疫原种类，依据其特性，这些免疫原可被划分为天然抗原、重组型抗原、合成型抗原及小分子型抗原几大类。其中，天然抗原范畴涵盖了病毒类免疫原，其纯化步骤繁琐，相较于其他免疫原，不仅难度提升，所需成本也更为高昂。病毒类免疫原进一步细分为全病毒灭活型疫苗、亚单位疫苗、病毒载体型疫苗及mRNA疫苗。全病毒灭活疫苗虽能有效激发免疫应答，但病毒已被完全灭活。腺病毒凭借自身的复制与表达能力来触发免疫反应，展现出高效且持久的免疫成效，然而其制备同样复杂，要求我们在生物安全层面实施严格监控。mRNA疫苗其导入细胞，促使表达，进而激发反应。至于小分子或多肽类抗原，它们可通过体外合成，但设计过程可能颇为复杂。小分子型抗原，如多肽与核苷酸等小分子化合物，由于本身缺乏免疫原性，故和载体结合后方可作为使用。
VHH结构的优势？及其应用？

答：其独特的分子结构使其具有良好的组织穿透性，更短的半衰期和更高的肾脏清除率，可透过血脑屏障，并且热稳定性严重。VHH 具有优异的温度稳定性。对VHH晶体结构的进一步检查表明，尽管VHH缺乏通常由VL和VH链形成的疏水裂隙，但VHH的CDR具有适应性，并且可能以多种方式结合。堆叠和电荷-电荷相互作用都发生在同时具有芳香族和亲水性的分子中。有研究人员使用三乙胺洗脱与固定化咖啡因/BSA 抗原结合的VHH噬菌体融合物，进行免疫，从文库中淘取咖啡因选择性VHH。VHH经证明具有热稳定性，在高达90℃的温度下孵育后可恢复90%以上的活性。通过检测市场上可用饮料范围内的咖啡因证明了该分析的准确性，其中咖啡因不是故意加标的。这些热稳定的咖啡因选择性VHH及其在一次性侧向层析装置中的应用已获得专利，用于在家中和餐馆监测饮料中的咖啡因。

什么是VHH抗体？

答：VHH抗体是研究人员发现的一种缺失VL的抗体，它的结构简单，仅由两条VH组成。纳米抗体是VHH组成的，那个易于识别和运送。之后，人们在羊驼和鲨鱼等其他动物中也发现了这种结构的抗体。虽然没有VL结构域，但仍然能够与抗原结合，是具有高度稳定性的单结构域抗体。泰克生物可以通过为客户提供包括文库构建和筛选，VHH纳米抗体构建等一系列服务，通过纳米抗体合成以及噬菌体展示开发平台，能够高效构建并筛选包括多种不同类型的噬菌体抗体文库，为我们的顾客提供专一的、高特异性的抗体解决方案。
VHH抗体发现服务包含哪些主要环节？

答：首先，泰克生物选择健康、无疾病的羊驼进行免疫，刺激其产生反应，这些动物能够产生单域抗体。从PBMC中分离单B细胞，抽提RNA，再逆转录成cDNA。最后将其做为模板，并通过凝胶电泳筛选目标VHH序列。对筛选得到的VHH抗体序列进行测序分析然后进行VHH抗体序列设计。通过引入某些特定突变进行筛选等方法，泰克生物获得更高稳定性VHH抗体突变体。然后将筛选得到的VHH序列插入适当的表达载体中（如质粒、病毒等），进行VHH抗体表达。最后通过噬菌体展示技术，让VHH抗体表达在噬菌体表面，然后利用筛选出能够反应的纳米抗体。泰克生物对其进行测序和验证，确保序列的正确性和功能活性。
VHH抗体发现服务的优势

答：VHH技术利用了基因工程中的大量进步，使得基因被常规地剪接在一起并重排，以提供具有上级结合力的工具，该工具易于纯化，同时还包含标记标签。利用高通量技术，可以在短时间内从大量候选抗体中选出具有特定功能的VHH抗体。VHH可以无限量\经济地生产，当暴露于热和溶剂时更稳定，并且可以进行基因操作以用于无数的用途，包括支架、标记和改变特定氨基酸。VHH适用于电化学生物传感器和装置等。我们推测结合结构域的更高密度将在增加的信号和因此更高的灵敏度方面提供突出的优势。VHH抗体在诊断和治疗、中枢神经系统疾病治疗等利用频繁。VHH 抗体对于监测食品和饲料中的霉菌毒素特别有用，因为它们很容易进行基因工程改造并且具有优异的稳定性。
VHH抗体发现服务我们如何进行免疫原的选择？

答：在免疫应答的进程中，我们采用了多样化的免疫原种类，依据其特性，这些免疫原可被划分为天然抗原、重组型抗原、合成型抗原及小分子型抗原几大类。其中，天然抗原范畴涵盖了病毒类免疫原，其纯化步骤繁琐，相较于其他免疫原，不仅难度提升，所需成本也更为高昂。病毒类免疫原进一步细分为全病毒灭活型疫苗、亚单位疫苗、病毒载体型疫苗及mRNA疫苗。全病毒灭活疫苗虽能有效激发免疫应答，但病毒已被完全灭活。腺病毒凭借自身的复制与表达能力来触发免疫反应，展现出高效且持久的免疫成效，然而其制备同样复杂，要求我们在生物安全层面实施严格监控。mRNA疫苗其导入细胞，促使表达，进而激发反应。至于小分子或多肽类抗原，它们可通过体外合成，但设计过程可能颇为复杂。小分子型抗原，如多肽与核苷酸等小分子化合物，由于本身缺乏免疫原性，故和载体结合后方可作为使用。
VHH结构的优势？及其应用？

答：其独特的分子结构使其具有良好的组织穿透性，更短的半衰期和更高的肾脏清除率，可透过血脑屏障，并且热稳定性严重。VHH 具有优异的温度稳定性。对VHH晶体结构的进一步检查表明，尽管VHH缺乏通常由VL和VH链形成的疏水裂隙，但VHH的CDR具有适应性，并且可能以多种方式结合。堆叠和电荷-电荷相互作用都发生在同时具有芳香族和亲水性的分子中。有研究人员使用三乙胺洗脱与固定化咖啡因/BSA 抗原结合的VHH噬菌体融合物，进行免疫，从文库中淘取咖啡因选择性VHH。VHH经证明具有热稳定性，在高达90℃的温度下孵育后可恢复90%以上的活性。通过检测市场上可用饮料范围内的咖啡因证明了该分析的准确性，其中咖啡因不是故意加标的。这些热稳定的咖啡因选择性VHH及其在一次性侧向层析装置中的应用已获得专利，用于在家中和餐馆监测饮料中的咖啡因。

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拥有免疫基地，多种驼源免疫可供选择，包括但不限于大羊驼llama、小羊驼Alpaca以及骆驼等，且动物来源背景清晰	多种抗体库噬菌体展示可选：VHH抗体库展示、scFv抗体库展示等	多种靶点抗体发现服务可选：蛋白、多肽、小分子、病毒、膜蛋白、 mRNA等	文库库容大：免疫文库库容10^9-10^10，天然文库库容10^10-10^12

文库筛选方式灵活：固相筛选、液相筛选、细胞筛选、磁珠筛选等	实验记录可追溯：QC质控标准（免疫效价、PBMC质控、文库质控及筛选验证质控），中英文实验报告，原始实验记录	一对一个性化方案定制（包括免疫方案、建库方案、筛选方案以及后续的体外表达验证方案等），满足各类客户的科研项目需求	可提供一系列配套的下游药物抗体开发服务，抗体体外表达验证、抗体人源化、抗体亲和力成熟、双特异性抗体开发、CAR-T先导序列分子设计等

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什么是VHH抗体？

VHH抗体发现服务包含哪些主要环节？

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