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酵母双杂交(核系统)服务
泰克生物致力于全新的药物抗体,靶向多肽药物的技术开发服务。我们搭建了完善的酵母表面展示技术系统,经过多年的项目积累后,结合我们靶向肽筛选(细胞筛选,动物体内筛选)的经验,我们特推出了细胞内环境水平互作发现验证体系,即酵母杂交验证体系。化繁为简,我们采用改进的SMART技术为客户构建cDNA酵母文库并提供衍生出来的系列酵母杂交验证服务。
█ 酵母双杂交技术(核杂交系统)基本原理
与酵母单杂交技术基本类似,均定位于细胞核中相互作用的验证。跟膜系统酵母双杂交技术相比,核系统酵母双杂交利用细胞核定位因子进行cDNA文库构建和互作验证。酵母中的转录激活因子具有两个不同的结构域:DNA结合结构域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域(activation domain,AD),上述两个结构可以单独发挥功能且互不影响,但是只有当二者在空间上充分接近,才能行使完整的转录激活因子的活性,使得受其调控的下游基因得到转录。因此验证定位于细胞核内部的互作时,GAL4转录因子均可以作为酵母单杂交技术与酵母双杂交技术(核系统)均的报告体系。泰克生物为客户提供高质量的酵母双杂交(核系统)技术服务(Yeast two-hybrid,即Y2H服务),包括已知蛋白的互作验证、基于酵母双杂交原理的蛋白自身的转录激活验证、膜蛋白与膜蛋白/胞质蛋白的互作验证等。
酵母双杂交技术(核系统)系统原理如图1所示:
图1 酵母双杂技术(核系统)示意图
如图1所示,转录因子GAL4类似于一个桥梁的作用,基本原理在于转录因子GAL4能够调控酵母半乳糖苷酶基因表达,当酵母发生半乳糖苷酶表达时,在含有X-gal的平板上半乳糖苷酶催化X-gal产生蓝色的菌落。转录因子GAL4含有两个能够独立发挥功能作用的结构域:转录激活结构域(AD)和DNA结合结构域(BD)。将含有各种cDNA序列的文库克隆进带有GAL4-AD的表达载体中,形成载体1;将顺式作用元件克隆带有GAL4-BD的载体中,形成载体2。然后将载体1和载体2共同转化进入同一个酵母细胞中,进行共表达:如果载体1中,cDNA-GAL4-AD表达后的融合蛋白能够结合载体2中的顺势作用元件,载体1中的GAL4的AD与载体2中的BD结合在一起形成完整的转录因子GAL4,GAL4与半乳糖苷酶基因上游结合,促使半乳糖苷酶基因表达后产生酶活催化作用(即报告基因)。
█ 酵母双杂交技术(核杂交系统)服务流程
图2 核蛋白酵母双杂交系统流程图
泰克生物建立了基于酵母双杂交的核蛋白互作验证平台、膜蛋白和胞质蛋白互作验证平台、酵母双杂交cDNA文库构建与筛选平台(可发现众多天然的、潜在的互作蛋白)。泰克生物构建的酵母双杂交cDNA文库/多肽文库的库容可达10^7-10^8,文库多样性、插入率均可达90%以上,满足各类客户对于酵母双杂交文库的质量要求。同时,泰克生物还能提供酵母双杂交文库构建与筛选的配套的下游表达验证和亲和力测定验证等一站式技术服务,客户只需要提供具体的靶蛋白序列信息、需要构建的文库种类以及样本信息,泰克生物的科学家均能够根据客户的需求进行合理的方案设计和个性化定制,助力客户的科研项目。
█ 酵母双杂交技术适样品要求
动物组织 | 单个样品>0.1g;样品尽量新鲜 | -80℃保存 |
种子 | 单个样品>0.2g | -80℃保存 |
细胞 | (1) total RNA:10^6cell/指标 (2) 浆/核RNA或蛋白:10^7 cell/指标 (3) 线粒体RNA或蛋白:2*10^7 cell/指标,样本尽量新鲜,细胞收取后直接加Trizol或直接冻存于-80℃ (4) 若细胞处理(加药、转染、感染)后状态差应酌情加大收样量 | -80℃保存 |
全血 | (1) 用抗凝管保存的外周血5~10ml,骨髓1~3ml;-80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μL,每400μL加入 400μLTrizol | -80℃保存 |
植物组织 | 单个样品>1g;尽量新鲜 | -80℃保存 |
█ 酵母双杂交服务内容和周期
步骤 | 服务内容 | 周期 |
选择1:酵母双杂交文库构建 | 1)总RNA提取(+mRNA纯化制备); 2)高保真RT-PCR制备cDNA;cDNA第二链合成 3)三框阅读框引物PCR+载体构建与转化:载体构建+初级文库鉴定(文库质粒扩增+测序与分析); 4)次级酵母文库电转制备+文库鉴定文库质粒扩增+测序与分析) 5)交付:酵母文库质粒1管(>500ug),酵母文库甘油菌10-20ml,实验报告 | 4-6周 |
选择2:酵母双杂交文库筛选 | 1)诱饵质粒合成 2)自激活验证+毒性验证+功能验证; 3)酵母筛选+复筛+阳性克隆测序+点对点验证; 5)交付:实验报告、测序原始数据 | 7-10周 |
█ 酵母双杂交服务优势
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平台成熟,周期快 | 性价比高,实验结果有保证 | 文库库容大,多样性高 | 实验记录可追溯:文库QC质控标准, 原始实验记录 |
答:酵母双杂交核系统(Yeast Two-Hybrid Nuclear System)是一种用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的经典技术。其基本原理是将目标蛋白分别与酵母的DNA结合域(BD)和转录激活域(AD)融合,在酵母细胞内表达。当这两个蛋白质发生相互作用时,DNA结合域和转录激活域会形成一个完整的转录因子复合物,激活报告基因的表达。与传统的酵母双杂交系统不同,核系统主要用于研究细胞核内的蛋白质相互作用,尤其是涉及转录调控、信号传导等核内过程的蛋白质。这使得核系统适合于研究那些在细胞核中发挥作用的蛋白质和复合体之间的相互作用。
答:酵母双杂交核系统主要用于研究核内蛋白质的相互作用。它在转录调控、基因表达、信号传导等细胞核内过程中的应用尤其广泛。通过该技术,研究人员能够揭示参与转录因子活性调控的蛋白质,发现新型转录因子及其合作伙伴,探索其在细胞内的作用机制。此外,酵母双杂交核系统还可以应用于研究核内的蛋白质复合体的组装、蛋白质翻译后修饰对相互作用的影响等。对于涉及疾病机制的研究,如癌症、神经退行性疾病等,酵母双杂交核系统也可以帮助识别疾病相关的蛋白质相互作用网络,从而为药物靶点的发现提供重要的基础。
答:酵母双杂交核系统与其他蛋白质-蛋白质相互作用检测方法(如免疫共沉淀、表面等离子共振等)相比,具有独特的优势。首先,酵母双杂交技术通过在酵母细胞内重建蛋白质间的相互作用,避免了体外环境可能影响蛋白质折叠和功能的限制。相比之下,许多其他技术需要纯化蛋白质,这可能导致在体外无法重建其天然的功能状态。其次,酵母双杂交核系统具有高灵敏度,能够检测到低亲和力的蛋白质-蛋白质相互作用,尤其适用于研究那些微弱的相互作用。第三,酵母双杂交核系统是一种高通量筛选方法,可以在短时间内筛选大量候选蛋白质的相互作用,尤其适合于大规模的蛋白质-蛋白质相互作用网络构建。
答:构建酵母双杂交核系统的实验平台首先需要选定适合的酵母菌株。一般来说,研究人员会选择具有较高转化效率且能够在高表达条件下稳定生长的酵母菌株。接下来,目标蛋白质的编码基因会被克隆到DNA结合域(BD)和转录激活域(AD)融合载体中,以便在酵母细胞中表达。这两个融合蛋白质在酵母细胞内表达后,如果它们发生相互作用,DNA结合域和转录激活域会接近并激活报告基因的表达。报告基因的活性变化可以通过颜色变化、荧光或酶活性等方式检测,从而判断蛋白质间的相互作用。完成这些步骤后,研究人员可以开始筛选与目标蛋白质相互作用的潜在配体,并进一步进行验证和功能分析。
答:酵母双杂交核系统广泛应用于发现转录因子及其共激活因子。在研究转录因子时,通常将目标基因的启动子区域或DNA结合位点克隆到酵母表达载体中,然后筛选与之结合的转录因子及其相关因子。通过将潜在的转录因子与DNA结合域融合并在酵母中共同表达,研究人员可以通过报告基因的激活来检测转录因子与DNA结合的能力。进一步地,可以通过添加不同的共激活因子或其他调控因子,筛选那些能增强或抑制转录因子功能的蛋白质。这种方法不仅有助于揭示转录因子的作用机制,还可以识别与转录因子协同作用的蛋白质,为转录调控网络的解析提供有力工具。
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