抗体人源化服务-泰克生物-酵母展示服务专家

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抗体人源化服务

抗体人源化技术源于对提高抗体疗法安全性和有效性的需求。异种来源的抗体，如鼠源抗体，兔源抗体，驼源纳米抗体（VHH抗体）直接作为靶向抗体治疗药物时，往往存在强烈的机体排斥反应，即所谓的免疫原性反应，为改善这种潜在的风险，来自全世界的科学家们共同创立抗体人源化这门技术，能够大大降低来自异种宿主的抗体的免疫原性，如纳米抗体人源（驼源抗体人源化/VHH 抗体人源化），鼠源抗体人源，兔源抗体人源化。

泰克生物建立了基于噬菌体展示技术（Phagepro Tech^TM）和酵母展示技术的抗体发现平台，以满足全世界不同客户对于抗体先导药物发现的需求。通过对筛选发现的抗体药物候选序列经过初步成药性评价后，为获得的候选抗体药物序列提供进一步的保证型抗体人源化服务，以满足客户的定制化需求。

抗体人源化的一般通用流程是获得抗体序列后，通过跟人源抗体种系基因数据库进行比对，获得亲缘相近的人源VH/VL种系基因模板；再通过IMGT，Kabat，Chothia等数据库进行抗体的FR（框架结构）和CDR（抗原决定簇）区域划分，通过CDR移植（CDR Grafting技术）技术形成100% FR人源化和部分CDR人源化的人源序列，最后通过回复突变的方式以获得跟亲本序列亲和力一致的人源化抗体。

如图1所示，经过IMGT，Kabat，Chothia等数据库确定CDR后，将CDR区域移植到人源种系基因序列中，经过比对后形成100% FR （框架结构）和CDR部分人源化的人源化抗体

抗体人源化示意图-泰克生物.png

图1 抗体人源化示意图

不同种属来源的亲本抗体氨基酸序列与人源抗体种系基因对应的氨基酸序列进行比较，FR区域差异各不相同：鼠源抗体与人源抗体序列，驼源抗体序列（VHH纳米抗体）与人源抗体序列以及兔源抗体与人源抗体序列，上述三者在FR区域存在差异化氨基酸是完全不同的，其中鼠源和驼源抗体人源化相对成熟（重点是VH的人源化），兔源抗体由于VH和VL对于抗体结合抗原的能力贡献值基本相当，因此人源化过程中，需要兼顾VH和VL的FR的差异氨基酸位点。泰克生物在10来年的人源化抗体开发中积累了大量的经验，对于不同物种来源的抗体进行人源化建立了一套完整且严谨的操作规程。通过大量的文献研究以及3D结构模拟技术，结合实际的抗体回复突变经验，对抗体FR区域中存在的可能影响人源化后抗体的亲和力，构象以及可溶性的氨基酸进行编码；再通过比对算法（如图3所示）获得候选人源化序列。

抗体人源化潜在回复突变位点-泰克生物.png

图2 抗体人源化潜在回复突变位点

亲本序列与人源化后序列3D比对示意图-泰克生物.png

图3 亲本序列与人源化后序列3D比对示意图

█ 抗体人源化实验流程

抗体人源化实验流程-泰克生物.png

█ 服务内容

步骤	服务内容	交付	周期
抗体人源化设计	-- 抗体结构模型建立 -- 人源抗体种系基因模板确定 -- CDR移植与回复突变设计	-- 5种人源化抗体变体及基因序列信息； -- 至少 1 个人源化抗体变体具有与亲本抗体相当的结合亲和力； -- 实验报告	3-6周
候选抗体表达	-- 基因合成+哺乳表达载体构建； -- 抗体小量表达；
抗体活性验证	-- ELISA验证：EC50验证（含亲本序列） -- 亲和力验证（BLi/SPR） -- FACS活性检测（可选）
人源化抗体表达纯化	-- 候选株扩大表达+亲和纯化

█ 抗体人源化服务优势

重链和轻链同时参与优化

改造后的抗体人源化程度>90%

人源化抗体的亲和力与初始抗体相当

可进行多物种的抗体人源化

抗体人源化服务常见问题解答

什么是抗体人源化？

答：现在已经产生了许多具有潜在临床应用的啮齿动物单克隆抗体。然而，由于小鼠抗体在人类中具有很强的免疫原性。尽管由小鼠-人嵌合抗体的发明有助于降低小鼠单克隆抗体在人类中的免疫原性，但嵌合抗体仍然诱导了HAMA反应，因为小鼠衍生的可变区足以触发人类的免疫反应。重链V结构域和轻链V结构域的CDR共同形成抗原结合位点，而框架区域构成抗原结合位点的支架。用于产生免疫原性较低的抗体的CDR接枝的概念源于这样一种假设，即小鼠单克隆抗体（供体抗体）的CDR可以替代人抗体（受体抗体）的CDR。尽管CDR移植在某些情况下是成功的，但已发现大多数CDR移植抗体不保留亲本小鼠抗体的抗原结合亲和力。这是因为某些框架残基与V结构域中的CDR残基密切相互作用。有研究人员发现，小鼠CDR残基单独转移到人类框架中可能会改变CDR的结构，从而导致抗原结合亲和力的丧失。为了识别这些残基，Queen及其同事使用了计算机生成的V结构域三维模型。通过将CDR残基与关键框架氨基酸一起从小鼠抗体转移到人框架中，生成人源化抗体。自从引入计算机引导人源化技术以来，已成功产生大量的人源化抗体。
抗体人源化的方法有哪些？

答：在过去的三十年中，见证了几种人源化方法的演变，包括CDR移植、特异性决定残基（SDR）移植、换肤、框架（FR）洗牌、FR文库和引导选择等。传统的人源化方法涉及将互补决定区（CDR）嫁接到合适的人类模板中。例如，研究人员将EGFR mAb的CDR移植到人类模板中，直到人源化mAb的一些框架残基突变回小鼠的框架残基，才发现可检测的信号；这个过程被称为反向突变。此外，一些人源化mAb仍然表现出免疫原性。因此，需要一种更有利的方法来选择人mAb模板。种系人源化方法涉及将小鼠单克隆抗体的CDR接枝到具有最高相似性的人Ab种系基因序列中。由于人类种系基因的克隆内体细胞超突变率低，移植的mAb可能具有低免疫原性。Tan等人使用种系人源化方法，将小鼠抗人CD28mAb的V区与人种系基因序列比对。Pelat等人用人类种系序列使35PA83人源化，并通过额外的反向突变重新获得亲和力。这些发现表明反向突变在维持mAb结合亲和力方面的重要性。然而，选择人mAb模板和随后的反向突变需要进行大量测试，这可能既耗时又昂贵。还可以使用噬菌体展示衍生的人抗体库，其中人体中的抗体库在体外展示在噬菌体上。
如何防止人源化后亲和力下降？

答：小鼠单克隆抗体（mAb）的人源化对于降低其在人类中的免疫原性至关重要。然而，人源化mAb通常会失去其结合亲和力。残基的缺失导致人FR和非人CDR之间的不相容。这些关键残基的反向突变通常用于恢复结合亲和力。CDR移植依靠计算机建模来识别决定残基的经典结构并设计反向突变变体。如果计算预测不精确，或者如果缺乏专业知识导致反向突变的关键氨基酸选择不足。与依赖于抗体结构或序列信息的理性方法不同，FR改组是一种经验方法，依赖于通过噬菌体展示构建和筛选大型和多样化的组合文库。该文库包含来自小鼠抗体的6个CDR，这些CDR与一组不同的人种系FR融合，其中包含几乎所有适合抗体人源化的重链和轻链人种系基因。大量的多样性有助于选择最佳的人FR组合，这些组合可以维持非人CDR的优势构象，从而实现持续的高亲和力。有研究人员开发了一个计算机模拟V（D）J重组平台，其中我们使用V（D）J人类种系基因序列，使用不同的人类种系模板设计了五种抗肿瘤坏死因子的人源化候选药物。
CDR移植过程中，我们遇到的问题和解决方案？

答:CDR区域是抗体与抗原结合的关键部位，直接决定了抗体的特异性。在CDR移植过程中，如果处理不当，可能会导致CDR区域的结构或功能发生改变。虽然CDR移植技术能够有效减轻非人源抗体的免疫原性问题，然而，若CDR区域与人源抗体框架区存在不匹配情况，仍可能触发免疫反应。在CDR移植前，通过生物学和化学分析精确鉴定CDR区域的关键氨基酸残基，确保在移植过程中这些残基得到保留。在CDR移植后，对人类框架区进行调整，以保持CDR的结构和功能。利用计算工具和算法进行分子模拟，预测氨基酸残基的变化变化的影响。采用高通量筛选技术对人源化抗体进行初筛，快速筛选出所需抗体。通过不断优化CDR移植技术、开发新的生物信息学工具和实验方法。
抗体人源化过程中，遇到的问题和解决办法？

答：在抗体人源化进程中，首要任务是确保不削弱其特异性，这就要求对抗体可变区实施精准改造，从而确保其结合抗原的能力不受影响。\n降低抗体的免疫原性，以减少临床应用时的免疫排斥，是抗体人源化的另一关键目标。为此，需对抗体的恒定区进行改造，进一步削减其免疫原性。同时，抗体人源化过程中还需确保抗体的稳定性，以维持其在体内的长期疗效。这涉及到对抗体结构的优化，旨在提升其整体稳定性。此外，提高抗体的生产效率，以降低生产成本，也是抗体人源化不可或缺的一环。这要求对抗体的基因序列进行优化，进而增强其在细胞中的表达效率。泰克生物采用CDR移植技术，能够把人源抗体框架区（FR）上接入非人源抗体的CDR区域，确保抗体特异性得以维持。回复突变过程涉及对FR区域的关键氨基酸实施精细调整，旨在提升抗体与抗原的结合效能及稳定性。通过对鼠源CDR与FR表面残基进行镶嵌或重塑处理，使其轮廓接近人抗体CDR、形式符合人FR，进而有效削弱免疫原性。

什么是抗体人源化？

答：现在已经产生了许多具有潜在临床应用的啮齿动物单克隆抗体。然而，由于小鼠抗体在人类中具有很强的免疫原性。尽管由小鼠-人嵌合抗体的发明有助于降低小鼠单克隆抗体在人类中的免疫原性，但嵌合抗体仍然诱导了HAMA反应，因为小鼠衍生的可变区足以触发人类的免疫反应。重链V结构域和轻链V结构域的CDR共同形成抗原结合位点，而框架区域构成抗原结合位点的支架。用于产生免疫原性较低的抗体的CDR接枝的概念源于这样一种假设，即小鼠单克隆抗体（供体抗体）的CDR可以替代人抗体（受体抗体）的CDR。尽管CDR移植在某些情况下是成功的，但已发现大多数CDR移植抗体不保留亲本小鼠抗体的抗原结合亲和力。这是因为某些框架残基与V结构域中的CDR残基密切相互作用。有研究人员发现，小鼠CDR残基单独转移到人类框架中可能会改变CDR的结构，从而导致抗原结合亲和力的丧失。为了识别这些残基，Queen及其同事使用了计算机生成的V结构域三维模型。通过将CDR残基与关键框架氨基酸一起从小鼠抗体转移到人框架中，生成人源化抗体。自从引入计算机引导人源化技术以来，已成功产生大量的人源化抗体。
抗体人源化的方法有哪些？

答：在过去的三十年中，见证了几种人源化方法的演变，包括CDR移植、特异性决定残基（SDR）移植、换肤、框架（FR）洗牌、FR文库和引导选择等。传统的人源化方法涉及将互补决定区（CDR）嫁接到合适的人类模板中。例如，研究人员将EGFR mAb的CDR移植到人类模板中，直到人源化mAb的一些框架残基突变回小鼠的框架残基，才发现可检测的信号；这个过程被称为反向突变。此外，一些人源化mAb仍然表现出免疫原性。因此，需要一种更有利的方法来选择人mAb模板。种系人源化方法涉及将小鼠单克隆抗体的CDR接枝到具有最高相似性的人Ab种系基因序列中。由于人类种系基因的克隆内体细胞超突变率低，移植的mAb可能具有低免疫原性。Tan等人使用种系人源化方法，将小鼠抗人CD28mAb的V区与人种系基因序列比对。Pelat等人用人类种系序列使35PA83人源化，并通过额外的反向突变重新获得亲和力。这些发现表明反向突变在维持mAb结合亲和力方面的重要性。然而，选择人mAb模板和随后的反向突变需要进行大量测试，这可能既耗时又昂贵。还可以使用噬菌体展示衍生的人抗体库，其中人体中的抗体库在体外展示在噬菌体上。
如何防止人源化后亲和力下降？

答：小鼠单克隆抗体（mAb）的人源化对于降低其在人类中的免疫原性至关重要。然而，人源化mAb通常会失去其结合亲和力。残基的缺失导致人FR和非人CDR之间的不相容。这些关键残基的反向突变通常用于恢复结合亲和力。CDR移植依靠计算机建模来识别决定残基的经典结构并设计反向突变变体。如果计算预测不精确，或者如果缺乏专业知识导致反向突变的关键氨基酸选择不足。与依赖于抗体结构或序列信息的理性方法不同，FR改组是一种经验方法，依赖于通过噬菌体展示构建和筛选大型和多样化的组合文库。该文库包含来自小鼠抗体的6个CDR，这些CDR与一组不同的人种系FR融合，其中包含几乎所有适合抗体人源化的重链和轻链人种系基因。大量的多样性有助于选择最佳的人FR组合，这些组合可以维持非人CDR的优势构象，从而实现持续的高亲和力。有研究人员开发了一个计算机模拟V（D）J重组平台，其中我们使用V（D）J人类种系基因序列，使用不同的人类种系模板设计了五种抗肿瘤坏死因子的人源化候选药物。
CDR移植过程中，我们遇到的问题和解决方案？

答:CDR区域是抗体与抗原结合的关键部位，直接决定了抗体的特异性。在CDR移植过程中，如果处理不当，可能会导致CDR区域的结构或功能发生改变。虽然CDR移植技术能够有效减轻非人源抗体的免疫原性问题，然而，若CDR区域与人源抗体框架区存在不匹配情况，仍可能触发免疫反应。在CDR移植前，通过生物学和化学分析精确鉴定CDR区域的关键氨基酸残基，确保在移植过程中这些残基得到保留。在CDR移植后，对人类框架区进行调整，以保持CDR的结构和功能。利用计算工具和算法进行分子模拟，预测氨基酸残基的变化变化的影响。采用高通量筛选技术对人源化抗体进行初筛，快速筛选出所需抗体。通过不断优化CDR移植技术、开发新的生物信息学工具和实验方法。
抗体人源化过程中，遇到的问题和解决办法？

答：在抗体人源化进程中，首要任务是确保不削弱其特异性，这就要求对抗体可变区实施精准改造，从而确保其结合抗原的能力不受影响。\n降低抗体的免疫原性，以减少临床应用时的免疫排斥，是抗体人源化的另一关键目标。为此，需对抗体的恒定区进行改造，进一步削减其免疫原性。同时，抗体人源化过程中还需确保抗体的稳定性，以维持其在体内的长期疗效。这涉及到对抗体结构的优化，旨在提升其整体稳定性。此外，提高抗体的生产效率，以降低生产成本，也是抗体人源化不可或缺的一环。这要求对抗体的基因序列进行优化，进而增强其在细胞中的表达效率。泰克生物采用CDR移植技术，能够把人源抗体框架区（FR）上接入非人源抗体的CDR区域，确保抗体特异性得以维持。回复突变过程涉及对FR区域的关键氨基酸实施精细调整，旨在提升抗体与抗原的结合效能及稳定性。通过对鼠源CDR与FR表面残基进行镶嵌或重塑处理，使其轮廓接近人抗体CDR、形式符合人FR，进而有效削弱免疫原性。

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