酵母双杂技术相关问题-酵母展示技术专题-泰克生物-酵母展示服务专家

酵母双杂技术相关问题

一．Y2H方法在筛选蛋白质相互作用时面临哪些问题？如何解决假阴性和假阳性的问题？

Y2H方法在筛选蛋白质相互作用时面临以下问题：假阴性：Y2H方法中的假阴性是指由于筛选方法的限制而无法检测到的蛋白质相互作用。例如，在经典的Y2H方法中，涉及膜蛋白的蛋白质相互作用大多无法检测到。为了解决这个问题，需要根据感兴趣的细胞亚蛋白组选择合适的Y2H策略。此外，Y2H中检测到的两个蛋白质之间的相互作用通常不是对称的，这意味着它取决于给定蛋白质在饵或猎物构建中的融合。融合的酵母报告蛋白或锚点可能会引起空间位阻，从而导致假阴性。其他导致假阴性的原因可能是酵母系统中不同或缺乏的蛋白质后转录修饰。在这种情况下，修饰酶可以与饵和猎物一起在酵母中共表达。此外，非常短暂的相互作用也可能无法被检测到。因此，为了解决假阴性问题，可以使用缺乏磷酸酶活性但保留与底物的亲和力的底物陷阱突变体来识别磷酸酶的底物。

二．在进行双杂交筛选时，选择最合适的载体系统是一个重要的决策。GAL4和LexA两种系统有什么优缺点？在进行筛选时，如何避免常见的陷阱？

GAL4和LexA是两种常用的双杂交系统，它们各自有优点和缺点。GAL4系统是最常用的系统之一，因为它是最早商业化的系统。它的优点是易于操作和广泛应用，但缺点是可能存在背景信号和假阳性结果。另一方面，LexA系统使用了细菌LexA蛋白的DNA结合域和VP16或B42AD的转录激活域。它的优点是可以避免GAL4系统中的内源性GAL4和GAL80蛋白的干扰，但缺点是操作相对复杂，并且需要使用额外的选择标记。因此，在选择载体系统时，需要权衡这两种系统的优缺点，并根据具体实验需求进行选择。在进行双杂交筛选时，常见的陷阱包括以下几点。首先，由于双杂交系统是一种全面筛选方法，可能会出现假阳性结果，即检测到的相互作用可能是人为的或无生物学意义的。其次，由于时间和空间的限制，两个相互作用蛋白可能从未在细胞内接近，或者在细胞内定位于不同的亚细胞结构中。此外，相互作用蛋白可能在胚胎发育或细胞周期的不同阶段表达。因此，在鉴定到相互作用蛋白后，还需要进一步确定其生物学意义。

三．互作抑制是评估两个蛋白质之间相互作用生物学意义的少数技术之一。如何通过双杂交技术筛选出影响靶蛋白与其伴侣结合的突变体？如何通过寻找结合抑制剂来恢复突变体的表型变化？

首先通过两杂交技术筛选出影响靶蛋白与其伴侣结合的突变体。一旦找到了突变体，就可以研究这种突变对表型的影响。然而，如果发现蛋白质A的突变体与蛋白质B不相互作用，不能排除与未知蛋白质C的相互作用也被废除并导致表型变化的可能性。因此，在第二步中，需要寻找结合抑制剂，即制作能够与突变体A相互作用并恢复表型变化的突变体B。这种方法已经被用于研究Ras/Raf信号通路。在确认两杂交结果之外，人们通常希望在酵母细胞之外进行相互作用的确认。因此，可以使用多种方法进行确认，如体外的“pull-down”实验和共免疫沉淀。大多数实验使用表位标记的蛋白质版本。另外，可以使用共定位实验来验证两杂交的相互作用。大多数情况下，可以确认在两杂交中发现的相互作用，尽管可能需要时间来找到最佳条件，因为大多数实验方案包括需要为每对相互作用进行优化的经验步骤。最有说服力的实验可能是通过共免疫沉淀内源性蛋白质来进行的。

四．双杂交技术的优势有哪些？

1. 体现了一种利用酵母宿主细胞作为活试管的体内技术。这种酵母系统比大多数基于细菌表达的体外方法或技术更接近更高的真核现实。该系统吸引人的特点是启动筛选的最低要求。与传统生化方法中有时需要大量纯化蛋白质或高质量抗体相比，只需要cDNA，全长甚至部分感兴趣的基因；

2.弱的和短暂的相互作用，更容易在双杂交中检测到，因为遗传报告基因策略导致显著扩增。在进行筛选过程中，要弱相互作用的识别与遇到的假阳性数量之间存在关联，说明是有用的。除了筛选文库的能力外，双杂系统还可用于分析已知的相互作用。这可以通过精确定位相互作用的关键残基或通过整个子域的功能表征来实现。通过进行半定量实验，人们甚至可以从双杂交实验中解释亲和关系。研究表明，双杂交方法预测的相互作用强度通常与体外测定的相互作用强度相关，从而可以区分高、中、低亲和相互作用。此外,肽与视网膜母细胞瘤（Rb）的结合亲和力，如由表面等离子体共振测定的，与双杂交测定的结果相关。

五．除了Y2H方法外，还有哪些方法可以用来验证高通量筛选结果？计算生物学在解决这个问题上有什么作用？

除了Y2H方法外，还有其他方法可以用来验证高通量筛选结果。根据参考信息中提到的，可以使用以下方法进行验证：1.生化方法：包括pull down assay、免疫沉淀和Biacore表面等离子共振等方法。这些方法可以研究物理蛋白质相互作用，但是pull down assay需要蛋白质复合物相对稳定，而Biacore则需要纯化的相互作用伴侣。这些方法对于瞬时蛋白质相互作用或与跨膜蛋白质的相互作用可能较困难。2.细胞内/原位方法：包括共定位、免疫组化和原位杂交等方法。这些方法可以提供两个蛋白质的共表达和共定位的信息，但通常不能提供直接相互作用的确凿证据。3.FRET方法：通过研究两个不同荧光物质之间的距离来研究相互作用的时空发生和生理意义。FRET只能在两个直接相互作用的蛋白质之间的距离在几纳米范围内时发生。然而，这些方法相对较为繁琐，并且只能应用于在更大的筛选中检测到的少数相互作用。计算生物学在验证高通量筛选结果方面发挥着重要作用。通过整合大量的生物信息学数据和计算模型，可以对高通量筛选结果进行验证和分析。例如，可以使用蛋白质相互作用网络分析方法来评估筛选结果的准确性和可靠。

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