重组抗体哺乳表达实验常见问题及解决方案-抗体改造与修饰专题-泰克生物-酵母展示服务专家

重组抗体哺乳表达实验常见问题及解决方案

一、重组抗体主要有哪些形式？

单链抗体和Fab是在原核生物中产生的最广泛使用的抗体片段。其他抗体形式已在原核和真核细胞中产生，例如二硫键稳定的scFv（ds-scFv）、结合scFv和Fab特性的单链Fab片段（scFab）以及双和多聚体抗体形式，如双抗体、三抗体、转运体或小抗体（miniAbs）包括由连接到寡聚结构域的scFv组成的不同形式，如免疫球蛋白CH3结构域、亮氨酸拉链、螺旋-转螺旋基序链亲和素或scFv-scFv串联。双特异性抗体形式在一个分子中结合了两个不同的抗原结合结构域。最小的抗体片段是骆驼重链抗体和单结构域抗体（dAb）的VHH。

对于大多数治疗应用，免疫球蛋白的Fc部分对作用方法至关重要，因为它介导效应功能，如细胞依赖性细胞毒性或补体系统的激活。因此，抗体片段已与Fc结构域融合，以恢复效应器功能和亲和力。

不同形式的重组抗体-泰克生物.png

图1 不同形式的重组抗体

二、如何提高重组抗体在HEK293细胞系中的表达量？

人胚胎肾（HEK）293细胞系由于能有效地转染质粒DNA而被广泛用于瞬时蛋白表达。用猴病毒40（SV40）大T抗原（称为HEK293T）或用EB病毒（EBV）核抗原1（EBNA1）（称为HEK293E）进一步转化一些衍生物，以介导分别含有SV40或EBV复制起源（ori）的载体的半稳定附加体繁殖。HEK293细胞中质粒DNA的瞬时转染也可以通过磷酸钙转染（180）、阳离子脂质体和聚合物如聚乙烯亚胺（PEI）大规模进行。

在HEK293-6E细胞系中瞬时产生IgG样scFv-Fc抗体，这是一种在悬浮液和化学精炼的无血清培养基中生长的具有未封闭版本的EBNA1的基因修饰变体，通过简单的摇瓶培养实现了高达0.6 g/L的体积产量。改进的生产培养基、补料分批补充和良好控制的生物反应器工艺允许更高的细胞密度和更长的生产时间，两者都提高了产量。

三、重组抗体的转染策略？如何促进转染稳定性？

（1）两个基因在同一载体上的单个启动子控制下表达；（2）编码HC（重链）或LC（轻链）基因的两个单独载体共转染。在第二种情况下，不同的可选择标记可能与HC或LC质粒相关，例如HC表达通过DHFR共表达选择，LC通过新霉素选择。

稳定转染所经历的转基因表达的可变性通常归因于整合的转基因拷贝的数量，以及宿主染色质结构中特定的整合位点。染色质可以细分为两种形式，转录活性的去致密的常染色质和存在于转录沉默状态的凝聚的异染色质。考虑到异染色质构成了基因组的主要部分，转基因在该区域整合并因此受到抑制的可能性很高，此外，可以假设重组DNA优先插入基因组DNA的区域，这些区域易受基因组缺失率的影响。目前有两种主要方法用于克服这些表达问题：（1）位点特异性整合-将转基因直接整合到已知的转录活性热点中；（2）在转基因两侧放置基因组DNA元件，以防止异染色质抑制并促进高转录活性。