重组单链抗体制备-抗体改造与修饰专题-泰克生物-酵母展示服务专家

重组单链抗体制备

单链抗体由连接在一起的抗体可变轻链（VL）和重链（VH）片段组成，因此通常也称为单链可变片段（scFv）。scFv的分子量范围为27000至30000Da，对于给定的抗体来说，scFv基本上是由携带整个抗原结合区的单个基因编码的最小抗体片段。一个可变片段的羧基末端通过长度通常为10-25个氨基酸残基的多肽接头连接到另一个片段的氨基。多肽连接体的选择取决于连接体的构象和长度在不施加任何主要立体结构的情况下连接两个可变链的适用性，并且也可以根据scFv的预期应用而变化。

scFv的分子设计-泰克生物.png

图一 scFv的分子设计

1.重组单链抗体制备

抗体片段的选择可以使用展示文库或亲和结合进行。通过展示库从天然或合成来源分离所需抗体的选择可以使用（1）噬菌体展示；（2）核糖体展示；（3）细菌或酵母系统中的细胞表面展示来实现。

1.1 scFv在大肠杆菌中的表达

细菌系统具有高蛋白表达（即每升几克的高效产量）、简单的培养程序和廉价的发酵成本的优点，从而生产出功能性和成本低的产品。细菌系统中缺乏糖基化能力并不会对scFv的表达产生负面影响，因为scFv分子不携带任何恒定的重链片段，因此不需要糖基化来获得生物活性或溶解度。与其他重组异源蛋白一样，单链抗体的表达效率取决于转录、翻译和正确折叠或重折叠的效率，这通常取决于每个单链抗体的内在性质及其与表达系统的相互作用。

细菌表达scFv片段可以通过细胞质分泌（即细胞质中的可溶性表达）、周质分泌或细胞质中包涵体的形成获得。周质分泌增加了正确折叠蛋白质的可能性，因为细胞环境的氧化性更强，有利于正确的二硫键形成。scFv蛋白的胞浆外表达由于易于随后的产物回收而有利于大规模生产。周质分泌产物的外牵引可以很容易地通过细菌外膜的渗透冲击来实现。考虑到存在的污染物谱相对较小，scFv蛋白的后续纯化也很简单。

1.2 scFv在哺乳动物和昆虫系统

当需要对产物进行翻译后修饰时，真核细胞能够充分识别真核蛋白合成、加工和分泌的信号，利用真核系统生产重组scfv蛋白是最优选择。有研究表明，在两种系统中，产生功能性scfv的效率相当（即在1至10 mg/L之间）。复杂蛋白需要正确折叠构象或翻译后修饰（如糖基化）来保持功能，尽管使用哺乳动物表达系统可能是不可避免的，但对于结构相对简单的scFvs来说，这种情况很少发生。微生物生产抗体片段可以证明在加工经济和生产量方面更有利。

用其他高阶真核生物系统来产生scFv并不罕见。所使用的方法易于按比例放大，以制备高产率和高纯度scFv抗体，无需任何亲和层析或重折叠步骤。如果上游经济能够得到优化，杆状病毒系统可能是大肠杆菌体系的有效替代品，用于大规模生产单链抗体的共表达。

1.3 scFv在酵母体系中的表达

酵母系统中scFv的产生通常包括以正确折叠的形式直接分泌到细胞质中，或直接分泌到细胞外的培养基中。细胞外分泌通常是可取的，因为它允许在一个步骤中同时进行产品纯化和回收。

在酵母系统中，高细胞密度发酵是一种成熟且有利的特征，其中scFv产品据报道已生长到5g/L的细胞密度。在不同的研究中，充分优化发酵条件（如培养基组成、曝气、诱导前渗透胁迫、诱导成分和温度）对提高scFv产量和质量的重要性已被证明是至关重要的。对于分泌蛋白，在大规模生产中一个常见的问题是它们在溶液中的稳定性。优化培养基组成以提高scfv的稳定性是提高整体产品收率的重要的第一步。虽然在酵母系统中生产scFv通常被报道为高表达水平，但仍需要制定下游回收策略以尽量减少产品损失。

泰克生物能够提供从序列分析（包括跨膜分析，亲水性分析等）、标签设计（包括但不限于亲和标签、促溶标签、生物素化标签等）、linker设计、载体构建设计、重组抗体表达到抗体纯化一站式重组抗体表达服务。同时，泰克生物还能提供抗体标记、亲和力验证、ELISA验证、流式验证、免疫学检测、药物抗体筛选等配套的下游检测和验证实验。

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