浅谈酵母双杂系统原理及应用-酵母展示技术专题-泰克生物-酵母展示服务专家

浅谈酵母双杂系统原理及应用

酵母双杂交系统是基于许多真核转录因子具有离散的、可分离的DNA结合域和转录激活域。在他们的系统中，通过将一种测试蛋白融合到酵母GAL4转录因子的DNA结合域，将另一种蛋白质融合到GAL4激活域，来测试蛋白质之间的相互作用。将融合蛋白在合适的酵母菌株中表达，通过检测GAL4应答报告基因的表达来检测其相互作用。

一．经典酵母双杂体系

早期的酵母双杂交系统是基于许多真核转录因子具有可分离的DNA结合和转录激活结构域的发现。将测试蛋白质与每个分离的主体融合，重建一种活性转录因子，从而促进测试蛋白质的相互作用。可以监测报告基因的表达，以检测相互作用，报告基因包含与DNA结合结构域（BD）结合的上游元件。最常用的系统是GAL4系统（其中使用酵母GAL4蛋白的DNA结合和活化主体）和LexA系统（细菌抑制蛋白LexA的DNA结合主体与大肠杆菌B42活化结构域结合）。

用于两种杂交实验的酵母菌株在氨基酸生物合成所需的许多基因中存在突变，如TRP1、LEU2、HIS3和URA3。如果生长培养基中没有这些氨基酸，酵母菌株将无法生长。这两个杂交质粒中的许多都携带了完成这些突变的基因，并允许选择转化酵母。

经典系统有两个主要应用。它可以用来确定两种已知的蛋白质是否相互作用，也可以用来鉴定由cDNA文库编码的与感兴趣的蛋白质相互作用的未知蛋白质。在另一种情况下，酵母双杂交系统成为研究参与特定疾病过程的蛋白质之间形成的相互作用网络的有力工具。

经典酵母双杂交系统的三个缺点是与转录阻遏物的潜在困难、诱饵构建体对转运基因的自动激活以及某些蛋白质不定位于酵母细胞核的问题。

二．其他酵母双杂交技术

技术名称	基本介绍
hSos/Ras招募系统	该系统依赖Ras信号通路的激活来拯救表现出温度敏感生长表型的酵母cdc25突变体。Cdc25en编码Ras鸟苷核苷酸交换因子（GEF）。如果cdc25表型被募集到激活yRas的酵母质膜上，它可以被人类mRas或人类Ras GEF hSos拯救。hSos与一种测试蛋白融合。第二个测试蛋白与v-Src肉豆蔻酰化信号融合，后者将其靶向酵母质膜。两种测试蛋白之间的相互作用导致hSos募集到质膜，并通过GDP或GTP的交换激活Ras信号通路。
Split-ubiquitin系统	在分裂的泛素系统中，感兴趣的蛋白质融合到泛素多肽的分离结构域。感兴趣的蛋白质之间的相互作用重新构成了一个活性的泛素分子，导致报告蛋白从泛素结构域中的一个结构域被蛋白水解切割。在该系统的一个变体中，主要设计用于研究膜蛋白之间的相互作用，使用转录因子a-LexA-VP16作为报告蛋白。对于经典的两种杂交酵母菌株，可以通过激活LacZandHIS3报告基因来检测蛋白质-蛋白质的相互作用。
Three-protein 系统	如果两种蛋白质之间的相互作用需要第三种蛋白质的存在，或者如果一种蛋白质与通过两种其他蛋白质相互作用形成的结构域相互作用，则在双杂交分析中可能会错过相互作用。已经开发了酵母蛋白-蛋白质相互作用系统来研究这些三元复合物的形成。它们基于与经典的两种混合系统相同的原理。其中两种蛋白质融合到GAL4蛋白质的DNA结合和激活结构域，而第三种则用nuclear定位信号表达。该系统的设计使得只有当这三种蛋白质在GAL4上游激活时结合在一起形成复合物时，才能检测到报告基因的活性。

三．酵母双杂交系统的应用

酵母双杂交系统已广泛应用于植物研究，用于分析已知的相互作用和分离新的相互作用伙伴。它已被用于研究涉及许多不同过程的蛋白质-蛋白质相互作用，如花发育、自交不亲和机制、生物钟、植物抗病性和植物激素信号传导。

泰克生物（Tek Biotech）经过多年的发展，积累了丰富的免疫学研究与检测经验，建立了完善的分子基础实验室平台。泰克生物（Tek Biotech）的酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system，Y2H）是由基于SMART法构建的文库、酵母菌株、严谨的报告基因、高表达载体组成的。

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