浅谈重组抗体酵母表达-抗体改造与修饰专题-泰克生物-酵母展示服务专家

浅谈重组抗体酵母表达

抗体是由B淋巴细胞产生的，能够参与体液免疫的免疫球蛋白，它由可变结构域、轻链可变区（VL）和重链可变区（VH）组成，重组抗体通过其可变片段去识别靶抗原。在骆驼、羊驼等驼科动物血清中发现了一种缺失轻链的抗体，它的结构简单，在没有Fc的情况下仍然具有抗体活性。1980年代，BIrd等人设计了单链抗体（scFv）作为VL和VH的遗传融合体，它通过短柔性肽去链接VL和VH。scFv是具有抗体活性的最小结合单元，也被称为纳米抗体，由于其缺少Fc结构域，因此它的体积很小，约为25 kDa，与全长抗体相比，它更容易渗透在肿瘤组织中，能够应用于靶向癌症治疗药物方面，同时，在检测试剂中也发挥着重要作用。

重组蛋白酵母表达系统：

重组抗体的结构复杂，大多数需要进行翻译后修饰，因此适合在真核表达系统中进行表达，但大规模的抗体制备成本较高。单链抗体的体积小，结构简单，能够在多种重组单链抗体表达系统中进行表达，并且不需要进行翻译后修饰，适用于进行大规模生产。常用的重组抗体表达系统有大肠杆菌表达系统、哺乳动物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、酵母表达系统。其中，酵母表达系统能够进行相对完善的真核表达，并且操作较为简单，利用毕赤酵母进行表达不会积累乙醇，并且能够做到与哺乳动物细胞相同的糖基化程度。在使用酵母表达系统时要将质粒线性化，并整合到基因组上，使得外源基因能够稳定存在。根据基因表达的目的来选择酵母表达载体，酵母表达系统载体可分为酵母胞内表达载体和酵母胞外表达载体，其中，酵母胞内表达载体有DGAP系列、pPIC3、5K，酵母胞内表达载体可使目的蛋白在胞内表达，避免酵母的过度糖基化，适用于在胞浆内表达非糖基化蛋白，酵母胞内表达载体具有表达水平高的特点，但后续的抗体纯化过程较为复杂。酵母胞外表达载体常用的是pPIC9K，它可以使目的蛋白分泌到胞外，后续的抗体纯化过程较为简单。

毕赤酵母和酿酒酵母是酵母表达系统中被广泛使用的宿主，具有类似哺乳动物蛋白表达系统的优势，还有原核细胞容易操作的优点，同时生产成本较低，且生产率较高。毕赤酵母的生长速率很快，可以高密度培养，并且可以做到胞内表达与胞外表达，由于毕赤酵母可以在无蛋白质培养基中进行培养，因此容易进行后续的分离纯化。但表达的蛋白质在翻译后修饰过程中会产生甘露糖残基，导致蛋白质半衰期变短，甚至产生免疫原性。虽然酵母表达系统存在一定的缺点，但依然有很多的单链抗体是由酵母重组抗体表达系统所制备的，从酵母重组抗体表达系统中获得的抗体可以用于治疗性药物的开发，例如，在毕赤酵母中大规模生产的单链抗体Nb11-59可以用于新型冠状病毒的治疗。

重组蛋白的GS115毕赤酵母表达鉴定结果图-泰克生物.jpeg

Fig. 1 重组蛋白的GS115毕赤酵母表达鉴定结果图

单链抗体的设计：

在设计单链抗体时，要根据目标抗原的特异性去选择VH和VL，之后要选择合适的连接肽（Linker）使两者能够维持正确的结构，通过基因合成将VH、VL和Linker的DNA序列拼接成完整的scFv基因。scFv主要的重组抗体表达系统包括原核表达系统与真核表达系统，不同的表达载体、融合标签，以及宿主菌都会产生不同活性的scFv，在制备单链抗体时常用的表达载体是带有强启动子、终止子的PET系列，噬菌体载体也可以作为一种选择，例如pIT2等。通过添加His标签进行亲和纯化，添加GST标签可以增加蛋白的可溶性，但在后续应用中要切除标签，scFv的细胞内定位可以通过添加GFP进行观察。通过酵母表达系统制备抗体时，常用的酵母宿主细胞有酿酒酵母和毕赤酵母，其中，酿酒酵母的安全性较高，但蛋白表达量较低，可能会造成过量糖基化和质粒丢失，适用于一些对糖基化要求不高的蛋白。毕赤酵母的翻译后修饰能力较强，容易控制表达水平，不会产生乙醇，且能够产生大量的重组蛋白，因此毕赤酵母是重组单链抗体表达的理想选择，能够广泛用于大规模单链抗体的制备。

泰克生物拥有丰富的重组蛋白酵母表达服务经验，可以为客户提供多种规模的蛋白发酵服务，配合我们完善的蛋白纯化平台，可以在短时间内为客户提供高质量的重组蛋白产品。泰克生物拥有完整成熟的酵母表达系统，提供从基因合成到酵母蛋白表达、抗体纯化的一站式服务，我们有pPICZaA、pGAPZaA、pPIC9K等多种表达载体以及X33、GS115和酿酒酵母等菌株，配合大规模发酵，可以提供工业级需求的服务，同时配备多种蛋白表达纯化方法，可以满足客户不同的蛋白表达需求，为客户定制完整的蛋白表达纯化方案。