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scfv抗体表达实验流程

        随着抗体工程技术的发展，单链抗体（single-chain variable fragment, scFv）因其分子量小、穿透性强、免疫原性低以及易于进行基因工程改造等优势，已成为基础研究、诊断开发和靶向治疗中的重要工具。相较于传统全长抗体，scFv仅包含抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），并通过一段人工设计的柔性连接肽（Linker）连接，从而在保留其抗原结合活性的前提下，大大简化了表达体系。其中，利用大肠杆菌原核表达系统进行scFv的生产，因其操作简便、周期短、成本低廉且易于放大，而被广泛采用。然而，scFv在原核表达过程中常面临如包涵体形成、蛋白错误折叠和低溶性表达等挑战。因此，建立一套稳定、高效的scFv表达与纯化方案，对于获得具有生物学活性的功能性抗体片段至关重要。


重组抗体-泰克生物.png


本文将scfv抗体表达实验流程分享，旨在为研究人员提供一份切实可行的技术指南。


1. 获得抗体重链可变区及轻链可变区序列：文库筛选后得到与靶标高亲和力的抗体序列。


2. 方案设计：柔性linker连接重链的C端及轻链的N端，轻链C端偶联Fc片段


3. 基因合成及重组表达载体构建：

①使用Trimercodon技术进行抗体基因合成AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA（横线区域为载体同源臂序列）

②利用同源臂中的酶切位点对载体及目的基因进行双酶切（选用同源重组的方式亦可）

③目的基因与载体连接：同源重组在酶促反映下通常50℃，连接20min；粘性末端在T4连接酶的作用下，室温反应2h

④转化：将连接好的重组表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞中进行复制（通常是DH5α感受态细胞）

⑤挑取单克隆并进行鉴定：挑取转化平板中的单菌落进行PCR鉴定或酶切鉴定，将符合预期的克隆质粒送去测序，检测插入序列是否正确


4. 转染宿主细胞


（1）哺乳动物细胞

①将测序正确的质粒进行大量抽提

②按照不同的转染体系进行瞬时转染（293F/CHO细胞）使其进行分泌表达

③5-6天（以具体的转染体系为准）进行WB验证（第一次尝试摸索条件时必须做，相同重组抗体后续表达时可以不用做）

④收样并纯化：收集细胞上清并与亲和纯化柱进行结合，摸索纯化条件并进行纯化。


（2）大肠杆菌表达（融合Fc片段的不能用可以用GST标签融合）

①将测序正确的质粒转化到表达宿主菌中（BL21或Rosetta）

②挑取单克隆进行诱导表达验证：验证重组抗体表达在胞质还是包涵体中

③放大诱导表达：胞质表达的抗体可以在16℃低温下诱导20h左右，包涵体37℃诱导16h即可（在胞质表达的抗体尽管量少一些也尽量选用胞质表达）

④收样：胞质表达的抗体收集完菌沉可以放入-80进行冰冻破环细菌结构，后用PBS重悬并超声，离心收集上清结合亲和纯化柱，然后进行亲和纯化

包涵体表达的抗体收集完菌沉可以放入-80进行冰冻破环细菌结构，后用PBS重悬并超声，离心收集菌沉，用8M尿素或盐酸胍进行包涵体溶解，完全溶解后离心取上清结合纯化柱，然后进行亲和纯化


5. 抗体纯化：Ni-NTA填料的纯化柱用不同浓度的咪唑进行梯度纯化，但是包涵体要用8M尿素/盐酸胍溶解的咪唑进行纯化，只不过纯化后需要进行梯度透析复性，将咪唑及尿素或盐酸胍去除，纯化后进行SDS-PAGE验证，必要的话也可以做个WB验证

Protein A/G纯化：针对融合Fc片段的抗体，首次纯化应用低PH盐溶液梯度洗脱，找到最适PH后再次纯化可以直接用此PH值洗脱。


6. 亲和力检测：流式细胞术、SPR、BLI等方式验证抗体和靶标的亲和力


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