重组抗体酵母表达实验常见问题及解决方案-抗体改造与修饰专题-泰克生物-酵母展示服务专家

重组抗体酵母表达实验常见问题及解决方案

Q1. 什么情况下适合使用酵母系统去进行抗体重组表达？

A1. 重组抗体的结构复杂，大多数需要进行翻译后修饰，因此适合在真核表达系统中进行表达，但大规模的抗体制备成本较高。酵母表达系统能够进行相对完善的真核表达，并且操作较为简单，利用毕赤酵母进行表达不会积累乙醇，并且能够做到与哺乳动物细胞相同的糖基化程度。

Q2. 在分析抗体序列时需要注意什么？

A2. 对重组抗体的基因序列的分析应该尽可能详细，确保基因序列的完整性和准确性。由于酵母对密码子的偏好性可能影响表达效率，因此要检查基因中是否存在稀有密码子。在酵母表达系统中，信号肽的选择决定了重组抗体能否正确分泌，因此要分析序列中是否需要信号肽。

Q3. 重组抗体酵母表达常用的表达载体有哪些？需要注意什么？

A3. 常用的酵母表达载体包括pPIC9K、pPICZaA、pGAPZaA，其中pPIC9K适用于高拷贝整合和稳定表达。可以在表达载体中插入启动子等确保重组抗体的高效表达，通过Igκ信号肽或IgH信号肽，去帮助重组抗体在酵母细胞内正确定位和分泌。通过添加His标签、FLAG标签等有利于进行抗体的亲和纯化。在使用酵母表达系统时要将质粒线性化，并整合到基因组上，使得外源基因能够稳定存在。

Q4. 在进行转化时常用的酵母宿主菌有哪些？后续的诱导表达有什么需要注意的事项？

A4. 常用的酵母宿主菌有GS115、KM71H等。常用的转化方法有电击转化和化学转化。在进行诱导时可以优化诱导条件，根据实验需求去调整甲醇浓度、温度、pH值、表达时间等。

Q5. 转化效率低会导致什么问题？该如何应对？

A5. 酵母转化效率低会导致无法获得足够的阳性转化子。一般要优化转化条件，如提高电击转化电压、调整电容和电阻值，确保转化过程在低温下进行，并使用高浓度的质粒和感受态细胞。

Q6. 在纯化过程中会遇到什么问题？该如何应对？

A6. 目的蛋白在纯化过程中或纯化后容易发生变性或降解。在纯化过程中应该保持低温操作，添加稳定剂，如甘油、蔗糖等，并且选择合适的缓冲液和pH值，来保护蛋白的稳定性。

Q7. 什么问题会导致重组抗体表达量低？该如何应对？

A7. 在进行重组抗体表达时选择的载体和细胞不匹配，可能导致蛋白表达量低，在选择载体时，要考虑载体的整合方式、整合拷贝数、5'非翻译区等因素对表达量的影响。使用的密码子如果在酵母中不是高频密码子，可能影响翻译效率，进而导致表达量较低，可以对基因序列进行密码子优化，以提高翻译效率。温度、转速、培养基等一系列酵母菌的培养条件如果不合适，也可能导致酵母表达量下降，因此需要根据酵母种类和表达需求去优化培养条件，确保酵母处于最佳生长状态。此外，酵母细胞内存在着多种蛋白酶，都可能导致目的蛋白在表达过程中被降解，可以通过选择蛋白酶缺陷型的酵母菌株或者在培养基中添加蛋白酶抑制剂去避免目的蛋白的降解。

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