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重组片段抗体表达介绍

一.抗体片段

 

每一个完整的免疫球蛋白(IgG)分子包含通过二硫键连接的两条重链和两条轻链。抗体片段(如Fab、scFv和VHH)体积小,比其全长抗体具有更好的组织或肿瘤穿透力。因此,它们在免疫治疗方面具有巨大的前景,尤其是在实体瘤方面。此外,它们的半衰期也较短,可用作放射性显像剂。然而,由于缺乏Fc区,它们不能引起Fc介导的抗体效应功能,如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。

 

二.抗体Fab片段

 

2.1 Fab片段结构

Fab片段(Antigen-binding fragment)又叫做抗原结合片段,是抗体结构中可以与抗原结合的区域。其由完整的轻链(可变区和恒定区)和部分重链结构(可变区和一个恒定区片段)组成,轻链与重链通过一个二硫键连接,体积较小,分子量为47-48 kDa。

2.2 Fab抗体的制备

(1)酶解法:Fab可以通过在单抗的基础上直接通过酶切获得,酶解法通常用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等酶对人免疫球蛋白G进行降解,得到F(ab')2,Fab,Fc片段等产物。这种方式优点是快速简单,但劣势也很明显,首先是需要单抗原料,一般数量有限且价格昂贵,另一方面,即使优化了全抗体的酶促切割后,得到的Fab往往会损失一定的免疫反应性。

(2)利用表达系统制备:重组Fab的优势比较明显,由于不具备Fc区,从而不需要翻译后修饰和糖基化,可以同时在原核和哺乳动物系统中表达。利用表达系统生产Fab片段,通常利用大肠杆菌表达系统与哺乳动物表达系统。大肠杆菌表达系统具有生产成本低、生产速度快等优点,但容易形成包涵体,复性后活性难保证。

(3)Fab抗体文库:利用噬菌体展示技术,先制备Fab片段抗体库,在经过数轮的筛选富集,即可得到高亲和性的Fab抗体。理论上,小鼠B细胞抗体库小于108,人的B细胞抗体库小于1012。而Fab组合抗体库可以达到1010-1013的级别,增加了筛选到理想抗体的可能性。

 

三.ScFv简介

ScFv抗体包含重链可变区(Variable heavy chain, VH)和轻链可变区(Variable light chain, VL),在两个可变区之间通过人工合成一种灵活的肽连接物将其连接,这种肽连接物在E.coil(大肠杆菌)中很容易表达,所以我们可以使用蛋白质工程来改善ScFv,如提高亲和性或改变其特异性。

3.1 噬菌体展示技术表达ScFv

从免疫得到的脾脏B细胞中提取总mRNA,通过逆转录得到cDNA,再通过特定的引物以cDNA作为模板扩增出轻链可变区和重链可变区DNA,再通过重叠PCR将轻链可变区和重链可变区通过Linker连接,得到总的ScFv基因,将ScFv 基因连接到pIT2噬菌体载体(含抗性基因),再转化到大肠杆菌(Ecoli TG1)中,这样一个ScFv库就初步建成了。再将含有ScFv库的Ecoli TG1与KM13辅助噬菌体共培养,使ScFv 展示在噬菌体表面,最终通过收集噬菌体颗粒扩大ScFv基因库。通过对目的ScFv噬菌体颗粒富集筛选得到产物并送去测序。

3.2 单链抗体的纯化

单链抗体缺乏在完整抗体中含有的Fc片段,因此普通的结合位点(Protein G)不能用来纯化抗体。通常,在scFv片段的C端加上HIS-tag,然后利用金属螯合亲和层析Ni-TED Purose 6 Fast Flow可以对单链抗体进行纯化。

 

四.纳米抗体(VHH)

 

纳米抗体(VHH)与普通抗体VH具有相同的结构域,即4个保守框架区(FR1/2/3/4)和3个互补决定区(CDR1/2/3)。普通抗体的VH中FR2内有四个高度保守的疏水性氨基酸残基(V42、G49、L50和W52),而在VHH抗体中,这四个氨基酸被替换成亲水性的氨基酸残基(F42或 Y42、E49、R50和G52),因此增加了纳米抗体的水溶性。

 

五.抗体片段的优点

 

(1)减少了Fc相互作用导致的非特异性结合(许多细胞具有结合 Fc 区的受体);

(2)在免疫沉淀和蛋白质印迹实验中,控制Fc与蛋白A或蛋白G结合;

(3)更有效地穿透组织切片,改善免疫组织化学(IHC)染色;

(4)减少大蛋白质表位的位阻,固相应用中抗原检测的灵敏度可能更高;

(5)消除抗原抗体结合研究中与Fc相关的效应功能(例如补体固定);

(6)利用X射线晶体学或NMR来研究免疫识别结构区,操作更简便;

(7)内源实验时的免疫原性低于完整抗体。

 

泰克生物具有完善的重组抗体表达生产平台,丰富的重组蛋白和重组抗体表达经验,基于噬菌体展示技术,我们能够为客户提供优质的重组抗体制备和筛选服务。同时,结合大规模重组蛋白发酵平台,我们能够为客户生产包括单链抗体(scFv),单域抗体,人源化抗体和Fc嵌合抗体等单克隆抗体。

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