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噬菌体cDNA文库构建介绍

cDNA文库(complementary DNA library)以组织中的mRNA为模板,反转录合成双链cDNA,各cDNA分子分别插入载体形成重组子,再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。代表特定细胞或组织中mRNA的文库。

cDNA文库是在基因组水平上研究某一生物特定器官、特定组织、特定的发育时期基因表达的前提和基础。传统的筛库方法是将克隆高密度影印到尼龙膜上进行菌落原位杂交筛选。此方法工作量大,而且必须使用放射性同位素。现如今,作为大容量文库(≥10^8克隆)中选择特异的结合肽或蛋白的强大工具,噬菌体展示技术的到来位cDNA克隆基因表达提供了发展的机会。

 

一.cDNA文库的优点

 

1. 使遗传物质为RNA病毒可建立文库;

2. 因克隆数比基因组文库少得多,易于筛选;

3. 从分化特异的细胞的cDNA文库中可分离到特异表达的基因。

4. 建库时已排除了其他的RNA,使假阳性率降低。

5. cDNA文库可在细菌中表达,可用多种策略进行筛选。

 

二.cDNA文库和基因组文库的区别

 

方法

cDNA文库

基因组文库

时效性

代表某一时期特定细胞或组织中mRNA的转录水平,仅反映某一时期特定组织表达的功能基因,不是全部基因。

包含该生物所有基因

 

序列组成不同

无间隔序列和调控区等非编码区

可显示基因组的全部结构信息,由于制备DNA片段的切点是随机的,所以每一个克隆内所含的DNA片段既可能是一个或几个基因,也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的临近DNA序列。

如何选择

在分离植物RNA、病毒基因、研究植物功能蛋白序列、分离植物特定发育阶段或特异表达的基因时应用cDNA文库

研究mRNA不存在的序列及基因组做图时必须构建基因组文库

  

三.用于噬菌体cDNA文库展示的载体

 

1. 丝状噬菌体

 

因为全长cDNA包含在3’末端的翻译终止子,原核表达时缺乏合适的核糖体结合位点(若该cDNA来源于真核细胞),确保cDNA在噬菌体表达的最实际的方法是将5’末端与载体基因融合。传统的构建方法是将目的基因与pIII或pVIII的N末端融合,并且普遍认为直接与任一个衣壳蛋白的C末端融合都与噬菌体装配不相容。因此,围绕这些限制条件设计了三个专门的载体:(1)把pIII与cJun的亮氨酸拉链融合,而翻译的cDNA产物与cFos(pJufo)的亮氨酸拉链的C末端融合。噬菌体装配时,拉链融合在噬菌体的末梢,因此壳体包裹的eDNA与它编码的产物相连。(2)直接相互获取法:利用小衣壳蛋白pIII的功能模块性,即eDNA通过与pIII的感染性结构域的C末端融合来表达,而蛋白探针放在pIII的C末端部分,包埋在噬菌体的核心,只有那些能在探针和特异性eDNA编码产物质检建立稳定相互作用的噬菌体才能恢复它们的感染性,同时用来在大肠杆菌中扩增。(3)小衣壳蛋白pVI的C末端表达在表面,因此一个富含甘氨酸的六肽基因VI(gVI)-cDNA的融合基因可以在噬菌体表面展示。蛋白pVI通过在pIII和噬菌体核心之间提供链接来稳定噬菌体的结构。

 

2. 溶解性噬菌体

 

在丝状噬菌体系统中,衣壳蛋白先组合成噬菌体颗粒,然后定位在外周胞质上。这种途径适应于有二硫键形成的蛋白(例如分泌蛋白或受体的细胞外结构域),但它与在还原环境下能正常折叠的eDNA编码产物不相容。事实上,大多数噬菌体颗粒内部结构相似,如λ噬菌体中,已经报道了与衣壳蛋白或尾部蛋白的C末端融合。衣壳蛋白用来显示和选择cDNA片段,这些片段来源于丙型肝炎病毒基因组、人脑以及小鼠的胚胎。在T4噬菌体中,衣壳蛋白WAC和SOC的C末端的溶解性。

 

四.噬菌体展示cDNA文库的构建流程(以λ噬菌体为例)

 

1.总RNA提取:向培养皿中加入Trizol试剂,确保细胞全部裂解;加入氯仿,室温放置;12000g,低温离心15min,吸取含总RNA的上层无色水相至一新的离心管;加入异丙醇,室温沉淀10min。12000g,低温离心10min,在管底可见RNA沉淀,弃去上清;加入75%乙醇,混匀后离心,弃去上清;待RNA晾干后,加入DEPC水溶解。取少量测定A260/280,用琼脂糖凝胶电泳鉴定提取效果。总RNA用Dnase I处理,除去杂质DNA,琼脂糖凝胶电泳观察除杂效果。

2.反转录合成cDNA:cDNA第一链合成;cDNA第二链的合成;双链末端修饰。

3.初级文库的获得:蛋白酶K的消化;SfiⅠ酶切;cDNA与λTTrriippllEExx 2载体连接;λ噬菌体体外包装。

4.初级文库的滴定:(1)挑取单克隆至LB(含麦芽糖/MgSO4)培养基,37℃140 rpm震荡过夜,使OD600达到2.0。5000 rpm离心5 min,弃上清,用7.5 mL 10 mM MgSO4重悬沉淀;(2)37℃预热LB/MgSO4固体培养基;(3)用λ稀释缓冲液稀释菌体(稀释范围1∶5-1∶20);(4)加1μL稀释的噬菌体至200μL XL1~Blue过夜培养物,使噬菌体37℃吸附10~15min;(5)加2 mL融化的LB/MgSO4顶层琼脂,混匀后立即倒入37℃预热的LB固体培养基;(6)室温冷却10 min,置培养皿于37℃6~18 h。噬菌体滴度的计算公式如下所示:

噬菌体cDNA文库-泰克生物.jpeg

 

 

5.初级文库的扩增:(1)从初级文库中挑取单克隆至15 mL LB(含麦芽糖/MgSO4)培养基,37℃140rpm震荡过夜,使OD600达到2.0。5 000 rpm离心5min,弃上清,用7.5 mL 10 mM MgSO4重悬沉淀;(2)37℃预热LB/MgSO4固体培养基。(3)用4 mL离心管将500μL细菌培养物与稀释的噬菌体混匀(使每平皿含有1×105噬菌斑);37℃水浴15 min;每管加4.5 mL融化的LB/MgSO4顶层琼脂;快速混匀,将细菌与噬菌体的混合物倒入LB/MgSO4琼脂培养皿,转动使其分布均匀;(4)室温放置10 min使琼脂凝固,将平皿放置培养箱37℃培养6~18 h,至噬菌体汇合;(5)每皿加入12 mL 1×λ稀释缓冲液,置于4℃过夜;噬菌斑被合并形成扩增的文库;平皿置水平摇床上室温50rpm摇动1 h;(6)收集λ噬菌体裂解物至无菌烧杯中,充分混匀后均分于50 mL离心管;每管加10 mL氯仿,涡旋振荡2 min;5 000 g离心10 min,收集上清至新管,盖紧放置于4℃。

 

泰克生物拥有M13,T4和T7噬菌体展示体系,根据客户的项目需求(展示的蛋白或抗体片段的大小等参数),会采用不同的噬菌体进行蛋白或者抗体的展示。噬菌体展示技术通过将外源肽段和噬菌体衣壳蛋白融合展示于噬菌体表面,进行高通量筛选及富集,并对所需功能的克隆进行定性分析,该技术展示对象涵盖抗体、抗体片段、肽段、cDNA等。在已完成的案例中,基于M13噬菌体pIII基因展示体系较为常用,构建的库容量可以达到10^11,其中有效库容量为10^9。同时,客户也可以提供抗原,进行体外外周血淋巴单核细胞敏化,以获得更高亲和力和特异性的单克隆抗体,通常基于该方法制备的抗体亲和力能达到10^-13 M级别。


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