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PBMC分离相关问题

想要在快速分离的同时保证PBMC的得率和纯度,需要注意一下几个方面:

 

一.抗凝剂的选择:

 

若后续需要进行ELISPOT实验以及细胞培养实验,采血时需要选择肝素抗凝剂,因为EDTA抗凝剂通过螯合钙抑制凝血,螯合钙可能在抗原特异性再刺激过程中损害细胞因子分泌。

 

二.最佳分离温度

 

包括分离管在内的分离产物的最佳分离温度为(20±5)℃。当温度过高时,主要由蔗糖组成的分离液密度会降低,一些淋巴细胞会进入分离层;如果温度过低,主要由蔗糖组成的分离溶液的密度会增加,红细胞在低温下也会减少聚集。因此,与室温条件相比,红细胞难以沉淀在分离溶液层下方,并且容易混合到PBMC层中。因此,在分离过程中,有必要确保血样和分离管都处于室温。

 

三.冷藏血分离注意事项

 

如果使用冷冻血液进行分离,PBMC层中的红细胞通常会更多,PBMC的活性会受到一定影响。建议在分离前将血样恢复到室温,并适当延长离心时间,例如30分钟。需要注意的是,如果血液样本冷藏很长时间,即使血液样本已经恢复到室温,离心时间已经延长,分离效果也无法与新鲜血液样本相比。建议将血液储存在室温下,储存时间不超过2小时。

 

四.血样用量

 

利用红细胞将原本位于管底的分离液置换到红细胞上方,分离液则将密度相对较小的PBMC和血浆顶到筛板上方,而血液中的红细胞数量是固定的,如果血液的用量太少,则分离后红细胞的置换效果差,PBMC可能会紧贴分离管中的筛板,难以吸出,此时即使稀释血样也无法改善分离效果。也因此红细胞沉降液并不推荐搭配分离管使用,沉降处理后红细胞量变少,置换效果差。

如果血液的用量太多,则可能导致红细胞超过筛板,PBMC层模糊、分离效果下降。综上,15mL分离管的血样推荐用量为3mL~6mL;50mL分离管的血样推荐用量为15mL~25mL。

 

五.取出PBMC的方法

 

使用分离管分离出PBMC后,可以选择直接倒出或吸出PBMC,若需要相对更高的细胞得率,可选择直接倒出筛板上方的液体;若需要相对更高的细胞纯度,可选择巴氏吸管或移液枪吸出PBMC。

 

六.使用什么方式进行PBMC计数

 

AO/PI:可以将有核的活细胞和有核的死细胞分开计数,且红细胞不染色,其中AO可以通过完整的细胞膜,嵌入所有细胞(活细胞和死细胞)的细胞核,呈现绿色荧光;PI只能通过不完整的细胞膜,即死细胞的细胞膜,嵌入所有死细胞的细胞核,呈现红色荧光。此时活/死PBMC可呈现荧光信号。而成熟的红细胞及血小板,因为没有细胞核,不能被AO/PI染色,因此可以完全被排除在外不被计数。

乙酸亚甲基蓝:3%乙酸亚甲基蓝可以计数有核细胞,但不能区分死活细胞。其中3%乙酸可以破坏细胞膜;亚甲基蓝可以结合核酸,使细胞核染色。细胞计数过程中所有细胞的细胞膜都会被裂解,但红细胞没有细胞核所以不会被计算在内。虽然3%乙酸亚甲基蓝计数法不能区分死活细胞,但一般来说红细胞会比死细胞多,所以这个计数法也可以使用。

台盼蓝:正常活细胞细胞膜结构完整,台盼蓝不能进入细胞内,活细胞呈透明状;通常细胞膜完整性丧失时,即可认为细胞已经死亡,因此对于死细胞或细胞膜不完整的细胞来说,细胞膜通透性增加,台盼蓝可以进入细胞内,把细胞染成蓝色,所以台盼蓝可以区分活死细胞,但不能区分红细胞和有核细胞。

 

泰克生物具有成熟的动物PBMC分离技术,保证细胞分离过程中不受损害、不被刺激,后期的纯化技术保证骆驼单个核细胞的纯度以及活率等技术指标,适用于后期的细胞培养、抗体制备等其他研究。

PBMC分离

从外周血、骨髓、外周淋巴器官或各种组织分离出来的细胞是多种细胞的混合物。如要研究某种特定细胞的结构、功能或表面标志等特征,首先要分离纯化细胞。细胞分离可根据其大小、密度、表面电荷、吸附能力或表面抗原的差异而采用密度梯度沉降法、贴附、亲和层析、化环形成、补体介导杀伤溶解、免疫磁珠以及流式细胞仪(FCM)等方法来进行纯化。

 

一.Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMC原理

 

常用来分离人外周血单个核细胞(PBMC)的分层液比重是1.077 ± 0.001 kg/L的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografn)(F /H)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体,呈中性,亲水性高,平均分子量为400000。当密度为1.2 g/ml仍未超出止常生理性渗透压,也不透过生物膜。红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底;淋巴细胞和单核细胞的比重小于分层液比重,离心后漂浮于分层液的液面上,也可有少部分细胞悬浮在分层液中,吸取分层液液面的细胞,就可从外周血中分离到单个核细胞。

 

图1 PBMC分离示意图

 

二.PBMC分离的实验步骤

 

1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。

2.取肝素抗凝静脉血与等量Hanks液或RPMI1640液充分混匀,用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上,注意保持清楚的界面。水平离心2 000 rpm,20 min。

3.离心后管内分为三层,上层为血浆和Hank's液、下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液,在上、中层界面处有一处以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带,单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外,还含有血小板。

4.用弯头滴管插到云雾层,仔细吸取单个核细胞;也可采用先吸弃上层RPMI 1640和血浆,然后收集富含PBMC的云雾层。将云雾层细胞置人另一短中管中,加人5倍以上体积的Hank's液或RPMI 1640,1500 rpm离心10min,洗涤细胞两次。

5.末次离心后,弃上清,加入含有10%小牛血清的RPMI 1640,重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2%台盼兰染液混合,于血球计数板上,计数四个大方格内的细胞总数。单个核细胞浓度(细胞数/1ml细胞悬液)=4个大方格内细胞总数/4×104×2(稀释倍数)。

6.细胞活力检测:死的细胞可被染成蓝色,活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。活细胞百分率(%)=活细胞数/总细胞数×100%。

7.细胞培养:细胞计数后调整细胞浓度为2×105/ml培养基,加于六孔板或24孔板中进行培养。

8.细胞收集:将六孔板或二十四孔板中的培养基吸出弃掉,每孔加200μL Trizol,用移液枪将孔壁吹打数次后,将Trizol转入EP管中。

9.细胞冻存:将收集的细胞放入-80℃冰箱中保存。

 

三.实验过程中的注意事项

 

1. Ficoll应适量,外周血应充分稀释。

2. 温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果。

3. 在Ficoll上加入稀释后的外周血时,应缓慢加,以免冲散界面。

4. 吸取单个核细胞层时,应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染。

 

四.泰克生物羊驼PBMC产品优势

 

1. 细胞活率高:实验中使用的分离试剂无菌、低内毒素,对细胞无伤害刺激,操作人员具备多年PBMC细胞分离经验,最大程度保证细胞的原始状态,分离后的新鲜细胞或冻存复苏后的活率可达90%以上。

2. 产品安全性高、无传染源:严格把控羊驼/骆驼全血来源,保证实验骆驼均经过相关传染源检测,为客户提供更安全、更放心的实验材料。

3. 细胞来源清晰、可溯源:分离羊驼/骆驼使用的全血均由正规动物中心提供采集,具备完全合规的采购流程以及全血生物安全证书,免除客户使用的后顾之忧。

 

泰克生物具有成熟的动物PBMC分离技术,保证细胞分离过程中不受损害、不被刺激,后期的纯化技术保证骆驼单个核细胞的纯度以及活率等技术指标,适用于后期的细胞培养、抗体制备等其他研究。


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