重组抗体哺乳表达实验常见问题及解决方案-抗体改造与修饰专题-泰克生物-酵母展示服务专家

重组抗体哺乳表达实验常见问题及解决方案

Q1. 什么情况下适合使用哺乳系统去进行抗体重组表达？

答：抗体的本质是免疫球蛋白，在进行真核蛋白表达时，会根据不同的真核蛋白表达需求选择相应的表达系统，哺乳动物细胞表达系统可以提供与天然细胞环境相似的细胞环境，适合用于结构复杂的真核蛋白表达，并且哺乳动物蛋白表达系统能够合成与人类自身蛋白的结构和功能相似的蛋白质，由哺乳表达系统进行抗体重组表达能够确保正确的翻译后修饰，如糖基化。利用哺乳动物细胞表达系统能够表达大量的蛋白，适用于大规模的重组抗体生产。此外，哺乳动物细胞表达的蛋白可以被分泌到细胞外，使得重组蛋白表达与纯化过程变得更为简单。基于哺乳动物细胞表达系统强大的翻译后修饰功能，哺乳动物蛋白表达也更接近人源蛋白的结构，因此，哺乳表达系统常用来进行治疗性的抗体开发。

Q2. 如何对给定抗体的蛋白序列进行分析？

答：首先根据客户要表达的蛋白及种属去查找蛋白信息，找到其氨基酸序列。然后进行跨膜分析、信号肽分析、亲疏水性分析，若蛋白中含有信号肽区域，在进行表达时信号肽区域需要被去除。当蛋白中存在跨膜结构域时一般用昆虫表达系统，最多能够跨7次。通过观察亲疏水性分析中生成图片的峰，可以去判断蛋白整体是亲水还是疏水，若为疏水蛋白则需要添加SUMO标签去促溶。在得出以上相关信息后可以进行后续的表达体系、酶切位点、标签和载体的选择。

Q3. 重组抗体表达如何进行设计？

答：重组蛋白表达的原理主要是将目标基因克隆至表达载体上，并转化到宿主细胞中，之后经转录和翻译过程去产生目标蛋白。在生产抗体时，常用的表达载体有质粒和病毒载体，可以在表达载体中插入启动子、转录终止信号等确保基因的转录与翻译是高效进行的。将抗体的基因插入到载体的适当位置，之后将构建好的载体转染到宿主细胞中，可以利用标记去筛选出抗体的稳定表达细胞株，用于大规模重组抗体制备。常用的抗体哺乳表达细胞有CHO细胞、HEK293细胞。通过添加His标签、FLAG标签等有利于进行抗体的亲和纯化。

Q4.常用的哺乳细胞转染方法有哪些？

答：在进行哺乳动物细胞转染时，主要采用瞬时转染或稳定转染。瞬时转染操作简单，可以在短时间内表达目的基因，多用于短期内蛋白的小规模合成。稳定转染能够用于长期的实验研究，进行哺乳动物细胞抗体开发。细胞转染方法主要包括物理转染法（电穿孔法、显微注射和基因枪等）、化学转染法（脂质体及其代替物、磷酸钙等）、生物转染法（各类病毒，包括腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒等）。

Q5. 在进行哺乳动物细胞培养时要注意哪些事项？

答：在进行细胞培养的过程中一定要注意无菌操作，防止细胞受到污染。在复苏细胞时，冻存管的管口不要接触到水面，以减少被水中杂质污染的可能。在进行细胞传代时，要根据细胞类型以及细胞状态调整胰酶消化的时间。细胞复苏和冻融时，要注意“慢冻速融”，以减少温度对细胞的损伤。培养细胞时应每天查看细胞的状态，当细胞生长良好且密度适中时可以进行传代。

Q6. 常见的细胞污染类型有哪些？如何预防？

答：根据污染源的不同，细胞污染主要分为物理污染、化学污染，和微生物污染。过冷或过热都会导致细胞状态发生改变，甚至引起细胞死亡，细胞暴露在放射线以及辐射中会破坏细胞的DNA结构，导致细胞死亡或者发生遗传变异。培养基、水、试剂等成分不纯或者浓度出现问题，都可能影响细胞的生长，甚至产生毒性作用，处理细胞时使用的试剂质量不合格也会影响细胞的生长。微生物污染是细胞培养过程中相对常见且较为严重的污染，根据微生物的种类又可以分为细菌污染、真菌污染、支原体污染，以及病毒污染。细胞一旦发生污染，就会影响细胞的状态，加长细胞培养的周期，影响实验结果，因此，应该保持细胞培养环境的干净整洁，并定期进行消毒，同时在操作过程中严格遵守相关制度，确保无菌操作。

泰克生物建立了完善的重组抗体哺乳表达体系，包括但不限于FreeStyle 293-F 细胞系、Expi 293-F细胞系、Expi-CHO-K1和Expi CHO-S等细胞系，配合泰克生物设计的哺乳动物表达载体（含有全长的CMV启动子以及优化后的分泌信号肽序列），能够为客户提供更高表达水平的重组抗体哺乳动物细胞表达与重组抗体生产服务。此外，泰克生物拥有成熟的载体-细胞-转染高效表达体系，能够缩短实验周期，为客户节省时间。

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