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固相筛选相关问题

固相筛选法就是将纯化或充足的抗原包被在固相介质上(如酶标板、亲和层析柱和免疫试管),然后再加入带筛选的噬菌体抗体库孵育,经过多次“吸附-洗涤-解离-扩增”的过程,洗去非特异性结合或结合力弱的噬菌体抗体,回收结合上的噬菌体抗体。下面是一些固相筛选实验过程:

 

一.抗原、抗体结合时间的选择

 

在包被抗原的ELISA板孔中,分别加入抗原噬菌体抗体以及非特异性的噬菌体抗体,结合时间可以设置1、10、20、30、45min及1、1.5、2h。用PBST洗涤5次后,加入1:5000 HRP-羊抗M13抗体,再加入PBST洗涤5次,加HRP底物显色液并终止后,测定A值。

 

二.洗涤条件的选择

 

在包被抗原的ELISA孔板中,分别加入上述类型的噬菌体抗体,反应2h后,采用不同的洗涤条件进行洗涤,以PBST洗5次,以PBS和PBST各洗5次,以PBS洗5次后再以PBST洗10次,以PBS和PBST各洗10次,之后同上进行噬菌体的ELISA检测。

 

三.缓冲液pH的选择

 

在包被抗原的ELISA板孔中,分别加入上述类型的噬菌体抗体,于37℃温育2h。分别采用pH3、4、5、6的醋酸/醋酸钠缓冲液洗涤10min后,同上进行噬菌体抗体的ELISA检测。

 

四.抗原包被浓度对筛选结果的影响

 

用浓度分别为1、2、4、6及8mg/L的抗原包板,加入100µL混合的噬菌体抗体,于37℃温育2h。然后以PBST和PBS各洗板20次,加入100µL E coli TG1,于37℃温育1h。然后稀释105后涂板,置30℃培养过夜。从不同筛选条件所得的平板上各挑96个单菌落,进行噬菌体抗体的竞争ELISA检测。

 

五.噬菌体抗体的竞争ELISA法检测

 

噬菌体抗体上清与等体积MPBS(含40 mLL牛奶的PBS)混合,室温静置30 min。同样,将样品与等体积含抗原的MPBS混合,室温静置30min。各取100μL加入到包被抗原的板中反应1 h,以PBST洗涤5次。加入1:5 000 HRP-羊抗M13抗体,于37℃孵育1h;同上洗涤后,加HRP底物显色液显色15 min,以2 mol/L H2SO4终止反应后,于波长450/620nm测定A值。抗原竞争达到50%以上的克隆视为阳性,即有抗原竞争的A值为无抗原竞争的A值50%以下的克隆即为阳性。

 

六.洗涤过程产生的影响

 

严谨度过高,可使一些表达较低的克隆被筛掉,而这些克隆中可能含有亲和性极高的目的噬菌体;严谨度过低,又可导致噬菌体的富集过程太慢,筛选轮数增加。考虑降低洗涤强度(PBS洗涤液中不加土温)以及减少洗涤次数。

 

七.抗原浓度的确定

 

现在普遍认为:低浓度的抗原应优先用于筛选高亲和力的抗体,而高浓度的抗原则有利于低亲和力抗体的筛选。需要注意的是,筛选用的抗原存在一个有效的浓度,不是所有用于包被的抗原都能有效的用于筛选,抗原的有效浓度必须要达到一定的值。但有效抗原浓度又不能高于10-6mol/L,此时反而会使特异性抗体的富集效果下降。

 

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