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纳米抗体文库构建

一.纳米抗体免疫文库

 

构建免疫文库最为特殊而重要的步骤是动物免疫,使骆驼重链V区胚系基因片段V、D和J在CDR3结构域随机位点处发生组合性重排。促使骆驼身体产生特异性重链抗体的方法类似于从其它动物中获取传统抗体,主要是周期性的连续给动物注射偶联有佐剂的抗原一段时间,使机体对抗原产生充分的免疫反应以生成特异性强、亲和力高的重链抗体。免疫结束后,从骆驼血液中分离淋巴细胞,提取总RNA,再以RNA为模版,进行反转录得到cDNA文库;根据重链抗体保守区域设计引物,采用巢式PCR技术经过2-3轮PCR扩增VHH基因片段,同时引入合适的酶切位点(如PstI和NotI)。接着,将VHH基因克隆到噬菌粒载体(如pHEN4和pMECS)上,与噬菌体基因II蛋白(gIIp)融合表达,从而展示在噬菌体表面以供特定的抗原识别筛选。再将重组的噬菌粒载体转化入大肠杆菌细胞并进行文库扩增,从而形成抗原倾向性的免疫文库刀。文库的质量一般可以从文库库容和多样性等方面进行评估。

 

二.纳米抗体噬菌体展示文库的构建

 

1.TG1电转感受态的制备

(1)将TG1细胞划线培养在LB板上,37 °C倒置培养过夜;

(2)挑取单个克隆接种在5 mL 2xTY培养基中,37 °C培养过夜;

(3)接种2 mL过夜培养的菌液至300 mL 2xTY培养基中,37 °C, 220 rpm培养至0D600为1左右;

(4)将菌液放在冰中1 h,1 h后将菌液转移至离心管中, 4 °C, 4000 rpm离心15 min;5)弃上清,加入等体积的1 mM,pH 7.0的Hepes溶液(冰上预冷)重悬菌体, 4 °C,4000 rpm离心15 min;

(6)加入1/2体积的10%甘油重悬菌体,4 °C,4000 rpm离心15 min;

(7)弃上清,每个管中加入10 mL 10%甘油重悬菌体, 4 °C, 4000 rpm离心15 min,弃上清,用枪吸去残留液,加入10%甘油至终体积1 mL。

2.TG1感受态细胞转化效率检测

(1)取2 μL pMECS质粒(10 ng/μL)加入到48 μL制备好的TG1感受态细胞,轻弹混匀,置冰上1 min。

(2)转入电击杯中(-20 °C预冷),电压设置为1700 V,进行电转,电转完立即用800 μL 37°C预热的SOC培养基混匀吸出,转至试管中;

3) 37 °C, 220 rpm摇床培养1 h,取出菌液,梯度稀释,最终取100 μL涂在LA+GLU板上,37 C培养过夜,计算转化效率;

3.噬菌体纳米抗体文库的形成

(1)感受态转化效率检测完成后,将100 μL的连接产物加至1 mL的电转TG1感受态中,混匀;

(2)在每个电击杯中(-20 °C预冷)分装40 μL感受态,将电击杯置入电转仪,1700V电击,使重组噬菌粒进入感受态细胞;

(3)电击结束后加入SOC培养基1 mL,吹打电击杯,转入37 °C预热的锥形瓶中,最后再用2 mL SOC培养基将所有电击杯洗刷一-次,转入锥形瓶,37 °C摇床培养1 h;

(4)1h后,将菌液收集到50mL离心管,25°C,4000rpm离心10min,用5mLSOC重悬菌体,取出50 μL用以梯度稀释,以便测定库容。其余菌液平均涂在10个LA+GLU板.上,37°C,培养16 h;

(5)将培养好的板取出,每个板加入5 mL液体LB培养基,用涂布棒将菌体刮下,倒入锥形瓶,再用3 mL LB冲洗-遍板,并入锥形瓶;

(6)将菌液转入50 mL离心管,25 °C,4000 rpm离心10 min,弃上清。加入30 mL15%甘油+LB液体培养基,漩涡振荡重悬,分装于1.5 mL EP管,-80 °C保存备用。

 

 

图1 文库构建流程

 

三.噬菌体构建技巧

 

噬菌体文库的库容量和多样性是衡量文库质量的重要标准之一,容量越大、多样性越好的库是成功筛选出纳米抗体的有效保证;

影响文库容量和多样性的关键点包括:提取RNA过程中RNA的降解、反转录过程中的模板和引物、扩增过程中引物的选择和模板的用量以及PCR扩增轮数、感受态细菌的转化效率、连接体系的大小等因素。

 

泰克生物可为客户提供来自驼源VHH纳米抗体库,以及其他物种scFv形式抗体的酵母展示文库构建及筛选服务。VHH纳米抗体库,又称为驼源重链抗体文库,抗体分子量大小为15kDa,是驼源动物产生的特有的一种抗体。酵母抗体文库展示体系受限于自身物理特性限制,物理库容滴度一般<107,因此主要应用于客户对项目库容要求不高,动物免疫后PBMC细胞经过二次分选以及避免漏掉二硫键形成的抗体发现项目。同时酵母展示文库相对噬菌体展示文库技术而言,前者在微量抗体表达后抗体活性层面相较于后者要高,得益此基础,在流式筛选时就能区分抗体的亲和力高低。

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