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文库筛选(液相筛选)

一.文库液相筛选原理

 

该方法是采用液相介质。首先利用生物素标记的抗原在溶液中结合表面呈现功能抗体的重组噬菌体,再利用亲和素偶联的琼脂糖或亲和素偶联的磁珠来捕获与利用生物素标记的抗原结合的重组噬菌体,从而实现对抗体库中功能抗体的富集;通过改变抗原浓度,结合-洗脱时间,能筛选得到高亲和力的抗体;或选择合理的筛选程序,如利用竞争二抗,去除无关噬菌体抗体,筛选针对特异表位的抗体。

 

二.液相筛选优点

 

1)筛选效率高,增加了噬菌体颗粒与抗原接触的机会,能有效地将低拷贝数或低亲和力的抗体从文库中分离出来;

2)解决了凝固后抗原表位被破坏的问题;

3)可根据文库容量、抗原相对分子质量和纯度等灵活调整筛选系统;

4)可在一定程度上预先确定所需的抗体亲和力。可根据文库容量、抗原相对分子质量和纯度等灵活调整筛选系统;

5)所需抗体的亲和力可在一定程度上预先确定。

 

三.液相筛选优劣势对比

 

液相筛选优势

液相筛选劣势

在液相中,抗原和噬菌体抗体都可以自由地运动,抗原与噬菌体抗体碰撞、继而结合的概率将大大增加;其次,抗原可以保持其空间构象,并且噬菌体抗体可以结合抗原所有的表位,而在固相筛选中,抗原有可能因吸附在固相介质上而导致部分表位的丢失。

生物素化的过程可能会破坏抗原表位,导致抗原抗体结合位点的失活;固相上的链霉素容易引起非特异吸附等。

  

四.液相筛选常用方法

 

磁珠筛选:磁珠纯化蛋白的原理是利用磁性珠子表面的亲和基团与目标蛋白质之间的特异性结合,将目标蛋白质从混合物中分离出来。磁性珠子通常是由磁性材料和亲和基团组成的,亲和基团可以是金属离子、抗体、酶、核酸等。当混合物中存在目标蛋白质时,磁性珠子上的亲和基团与目标蛋白质结合,形成磁珠蛋白质复合物。然后,通过磁场的作用,将磁珠蛋白质复合物集中在一起,从而实现目标蛋白质的分离纯化。

 

五.磁珠筛选步骤

 

使用Tris-HCl-Tween缓冲液(TBST)洗涤亲和素标记的磁珠,用BSA封闭备用。

(1) 包被磁珠:用1nmol生物素化抗原和1nmol游离生物素分别与500μL封闭后的磁珠在室温下孵育1小时。使用磁性架将磁珠吸附在上面,去除上清,再用TBST洗涤后重悬于含1%BSA的TBS中。

(2) 负向筛选:在生物素包被的磁珠中加入1mL扩增好的噬菌体抗体库,在室温下孵育1小时。再用磁性架吸附磁珠。

(3) 抗原筛选:就上述得到的上清移入生物素化的抗原磁珠中,在室温下孵育1小时,再用磁性架吸附磁珠,去掉上清。TBST洗涤10次,去掉上清。

(4) 洗脱:加入250μL 10μg/mL胰蛋白酶,混匀30min。

(5) 取120μL洗脱的噬菌体加入到1.5mLTG1中,在37℃条件下水浴30min,离心后加200μL TES缓冲液,均匀涂布在TYE-A-G平板上,剩余的加甘油保存。

(6) 次级库的制备:次日洗下菌苔接种于新鲜培养基中培养,向其中加入辅助噬菌体KM13,侵染30min后,重悬沉淀物,在37℃培养1h后加卡那霉素至终浓度为50μg/mL,30℃培养过夜,次日离心后,将上清倒至遇冷的PEG/NaCl中沉淀噬菌体,制备出次级库。

 

六.蛋白偶联步骤

 

计算需要偶联的蛋白,抗体量一般每毫克活化的羧基磁珠可以偶联20-500ug的蛋白(抗体)。可适量添加一些载体蛋白,如BSA Fraction V,增加反应体系中的总蛋白量,从而可以起到一定的封闭作用。保证抗体偶联的正确方向。

(1) 将蛋白加至5mL MES缓冲液中,(吸取50μL蛋白液于950μL的MES缓冲中,配成1: 20的稀释液标记为偶联反应前蛋白液,置于一旁用于后面的偶联率计算。

(2) 将剩下的蛋白液加到装有活化磁珠的离心管内,剧烈振荡混匀,室温下,将离心管置于旋转混匀仪上偶联反应16-24小时。(将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后,用吸管小心收集上清,标记为偶联后蛋白液,用于计算偶联率。

(3) 重悬磁珠于5mLMES缓冲液中,振荡摇匀。将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后,用吸管小心移弃上清。

(4) 重复步骤(3),重复加5mL的淬灭液,振荡摇匀,室温下,将离心管置于旋转混匀仪上30分钟。将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后,用吸管小心移弃上清。

 

七.优化液相筛选方案

 

可以将固定化金属亲和层析(IMAC)技术引入到噬菌体抗体库的筛选中,将纯化的带有His标签的抗原与噬菌体抗体库混合,噬菌体抗体与抗原充分结合后再加入亲和介质,使噬菌体抗体抗原复合物通过His标签与介质结合,然后通过充分洗涤去除非特异性噬菌体抗体,最后将特异性噬菌体抗体解离下来,感染TG1,在进行下一轮筛选,是一种改进的液相筛选方法。

 

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