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嵌合抗体介绍

一.嵌合抗体简介

 

-鼠嵌合抗体,即抗体的可变区来自鼠单克隆抗体,而恒定区则来自人的抗体。它是通过从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因,与人Ig恒定区基因连接,插入适当表达载体,转染宿主细胞表达产生。嵌合抗体既保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力,又大大减少了鼠源性在人体内的免疫原性,其半衰期明显延长,且在介导CDC及ADCC方面亦明显增强。

 

嵌合抗体-泰克生物.png 

1 嵌合抗体示意图

 

二.嵌合抗体制备(关键技术与方法)

 

1. 可变区基因克隆

1.1 RNA提取及反转录

取对数生长期的杂交瘤细胞株约107个细胞,按照Trizol RNA提取试剂盒的说明书抽提细胞的总RNA,再进行RT-PCR扩增,回收纯化扩增产物备用。

1.2 扩增轻链、重链的V区基因

根据Orlandi等(1989)设计的扩增小鼠可变区基因的引物,以上述扩增产物为模板扩增抗体基因的可变区。回收重链VH(约360 bp)、轻链VL (约330bp)片段,插入Teasy载体,各送3份样品测序。测序所得序列在GeneBank核酸数据库中进行分类及同源性分析。

两端加入酶切位点:根据上述PCR产物序列设计含酶切位点的引物,再次进行扩增,以使抗体可变区基因片段具有与载体相吻合的酶切位点,便于插入表达载体。回收纯化扩增产物备用。

2. 嵌合抗体表达载体构建

2.1 改造含信号肽人Ig重链和轻链C区基因片段的单克隆位点

设计含重链信号肽起始位点序列及酶切位点Nhe I的上游引物HLF (KOZAK+4G,即GCCGCCATGG),和含Xho I位点的下游引物HLR,以质粒pAc-K-CH3为模板,扩增出重链信号肽基因片段;设计含XhoI和KpnI位点上游引物HCF,和含Furin(RKRR)序列及酶切位点Xba I的下游引物HCR,以质粒pAc-K-CH3为模板,扩增出重链恒定区基因片段片段;用Xho I连接上述片段得到含重链信号肽、MCS及重链恒定区的基因片段。

设计含酶切位点Apa I的上游引物LLF,和含EcoR I位点的下游引物LLR,以质 粒pAc-K-CH3为模板,扩增出轻链信号肽基因片段;设计含EcoR I和Hind I位点上游引物LCF,和含Pme I的下游引物LCR,以质粒pAc-K-CH3为模板,扩增出轻链恒定区基因片段片段;用EcoR I连接上述片段得到含轻链信号肽、MCS及轻链恒定区的基因片段。

2.2 构建含信号肽及人Ig重链和轻链C区基因片段表达空载体

用合成的含酶切位点(XbaI和ApaI)的2A序列连接上述重、轻链,得到含信、号肽及人Ig重链和轻链C区基因的基因片段LigC (Leader + Ig Constant)。然后与Nhe I和Pme I双酶切过的pcDNA3.1-CA大片段连接,即得到嵌合抗体真核双表达载体 pcDNA3. 1-CA( chimeric antibody, CA)。

嵌合抗体-泰克生物1.png 

2 pcDNA3.1图谱

 

2.3 插入含数源Ig重链和轻链V区基因

双酶切表达载体pcDNA3.1-CA和纯化的VL,经琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段后,连接、转化大肠杆菌,筛选出pcDNA3.1-CA-VL阳性克隆,富集培养后提取质粒进行酶切鉴定。然后,双酶切表达载体pcDNA3.1-CA-VL和纯化的VH,分离纯化相应的酶切片段,重复上述步骤,构建成重组表达载体pcDNA3.1-CA-XX(抗原单词的首字母)。

3. 转染Sp2/0细胞

接种适量Sp2/0细胞于培养瓶中,培养12h后用纯化的载体pcDNA3.1-CA-XX DNA,采用Lipofectamine 2000试剂转染,按试剂盒使用说明书进行。设置空载体和无载体的细胞为对照。转染72h后,加含MTX的选择性培养基进行筛选。2周后将生长出的阳性克隆利用有限稀释法单克隆化。

4. 阳性克隆鉴定与筛选

以间接法用抗原和酶标羊抗人IgGFc片段抗体检测嵌合抗体的特异性及重组性。以适量抗原包被酶标板,加细胞培养上清反应后,再加羊抗人IgG Fc片段-HRP酶标抗体(经鼠Ig吸附过)孵育,显色后测A490吸光值。

5. 抗体腹水生产

腹腔种植转染瘤细胞,5~7天后抽取腹水。一只种植杂交瘤细胞的小鼠有时可产生多达10ml的腹水。王硕等(2003)报道称从腹水中获得的嵌合抗体产量可达1~2mg/ml。

 

三.嵌合抗体的应用

 

嵌合抗体目前主要用于药物治疗方面,与鼠抗相比,嵌合抗体既保留了鼠源可变的高亲和性,又具有人Fc段的多种免疫杀伤功能,从而大大降低了人抗鼠抗体反应的发生几率,改善了临床治疗效果,与其它小分子基因工程抗体相比,嵌合抗体作为完成的抗体分子,在体内半寿期更长,并具有人Fc段的多种免疫杀伤功能。

 

泰克生物多年来致力于抗体领域研究。抗体人源化是重组抗体生产制备实验研究的重要组成部分,获得高特异性和亲和性的人源化抗体,对很多疾病进行有效的抗体治疗具有重要作用。我们具有丰富的抗体工程构造经验,基于抗体噬菌体展示文库平台,我们能够提供高亲和力和低免疫原性的嵌合抗体改造服务


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