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酵母双杂交服务

泰克生物(Tek Biotech)经过多年的发展,积累了丰富的免疫学研究与检测经验,建立了完善的分子基础实验室平台。泰克生物(Tek Biotech)的酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system,Y2H)是由基于SMART法构建的文库、酵母菌株、严谨的报告基因、高表达载体组成的。

酵母双杂交系统是一种在基因水平上使用遗传和分子方法来检测蛋白质之间相互作用的免疫学测试技术。这种方法只需要构建质粒,没有涉及蛋白纯化和抗体免疫阶段,同时又能方便快速地获得相互作用的蛋白质的编码基因。Y2H可以用来筛选与靶蛋白相互作用的蛋白基因序列,也可以研究已知蛋白间的相互作用原理。

泰克生物(Tek Biotech)既能够提供蛋白互作检测服务,包括免疫共沉淀(Co-IP)、Pull-down等实验,实现对蛋白,小分子,抗体等相互作用的定性定量分析;也能进行ELISA、Western Blot等常用的免疫学检测技术。

 

█ 酵母双杂交系统(Y2H)的原理:

 

酵母双杂交系统原理-KMD Bioscience1.png 

图1 酵母双杂交系统原理


DNA结合域(Bonding Domain, BD): BD是一种能够与特定的DNA分子序列结合从而调节基因表达和自我复制的蛋白质结构域。DNA BD存在于转录因子等许多基因调控元件中,赋予这些调控元件识别并结合特定DNA序列的功能,从而达到对下游基因调控的目的。

转录因子激活域(Activation Domain,AD):AD是一段能够在在转录过程中激活基因转录的功能性蛋白质序列,常存在于转录因子蛋白质中。AD可以通过与其他调控因子的相互作用形成蛋白质复合物(转录因子、共激活因子和基因调控复合物等),从而使转录因子获得可以结合到DNA特定序列,然后招募其他转录因子和RNA聚合酶来启动转录的功能。因为每个转录因子只能结合到特定的序列上,所以这个过程是高度特异性的。

在酵母双杂交系统中,将DNA BD和转录因子AD分别与Bait蛋白X融合和Prey蛋白Y形成融合蛋白。BD-Bait X融合蛋白可以识别并结合报告基因的上游激活子序列(Upstream Activation Sequence, UAS)。同时如果Bait X蛋白与Prey Y蛋白之间具有相互作用,这会使DNA AD与转录因子BD重新结合构成具有启动报告基因功能的结构域。

酵母双杂交及系统是一种在细胞核中进行利用基因水平技术来鉴定和检测细胞核和细胞质蛋白之间相互作用的方法。同时,Y2H也可以使用蛋白质作为诱饵从所需的细胞类型、组织或整个生物体制备的蛋白质片段库来进行筛选,然后通过对所选酵母菌菌落中相应的质粒进行测序,从而确定相互作用。Y2H是在真核生物酵母中进行的,具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。

 

█ 酵母杂交检测服务的分类:


为了研究蛋白质的相互作用,科学家根据传统的Y2H系统,开发了几种系统以适应不同蛋白质的不同亚细胞定位和生化特征。泰克生物(Tek Biotech)为客户提供多种系统的服务,以适应不同项目的不同需求。



(1)酵母单杂系统(Yeast one-hybrid system,Y1H):研究蛋白质-DNA相互作用。


酵母单杂交系统原理-KMD Bioscience2.png 

图2 酵母单杂交系统原理


酵母单杂交系统需要将Bait DNA序列整合到酵母基因序列中。将Prey蛋白构建到AD载体中,与转录因子GAL4的AD结构域融合表达。如果Prey蛋白能够识别并结合Bait DNA序列,Prey蛋白所融合表达的AD结构域就可以招募转录复合物以激活报告基因的表达。



(2)酵母三杂交系统(Yeast three-hybrid system,Y3H):研究两个蛋白质和第三成分(蛋白、RNA或小分子)间的相互作用。


酵母三杂交系统原理-KMD Bioscience3.png 

图3 酵母三杂交系统原理


在酵母三杂交系统中,将两个RNA结合蛋白X,Y分别于DNA BD和转录因子AD结合形成两个融合蛋白。第三种成分可以为这两个RNA结合蛋白X,Y提供两个特定的RNA靶点来连接两个融合蛋白。


(3) 膜酵母双杂交系统(Membrane yeast two-hybrid system,Mb Y2H):用于研究膜蛋白



膜酵母双杂交系统原理-KMD Bioscience4.png 

图4 膜酵母双杂交系统原理


泛素(Ub)是一种蛋白质,可以通过实验被分离成两个基团,并且当它们靠近彼此时,其功能又可以进行重构。

在Mb Y2H系统中,将目标膜蛋白Bait融合到半个泛素(Cub,泛素分子被截断后的C端)上,并且Cub上还连有一个含有人工转录因子(TF),该TF由细菌LexA-DNA BD和单纯疱疹病毒VP16蛋白AD组成。将另一种目标蛋白Prey(膜蛋白或细胞质蛋白)融合到另外半个改造泛素(NubG/NubA,是将泛素分子被截断后的N端进行改造,从而降低Cub与Nub两者之间的亲和性,避免其发生自发重组现象)上。所以只有当结合在NubG/A的蛋白质和结合在Cub的蛋白质间相互作用时,才能使两个半个泛素分子结合形成可以被泛素特异性蛋白酶(UBPs)识别作用的完整泛素分子。然后在酶的作用下,连接在Cub的调控因子被释放进入细胞核中,从而结合在特定的DNA序列上来激活转录报告基因。

 

█ 服务优势:

 

-- 技术专家直接服务,满足不同检测需要

-- 高准确度分析仪器,经验丰富的操作以及严格的质量管理,保证结果准确可靠

-- 检测服务效率高,过程实时监控

-- 检测仪器灵敏度高,样品消耗量低

-- 实验周期短,节省等待时间

-- 提供真正的一站式服务:从构建文库到阳性克隆的筛选,这样可提高效率,避免错误,从而为客户从客观上节省费用


█ 服务内容


服务流程

内容

周期

客户提供

不少于2 μg的质粒(含诱饵靶基因)以及该基因的DNA序列,以便我们设计合成方案,进行人工合成(需收费)

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创建BD-X诱饵

将诱饵靶基因连接到Y2H载体中去,并测序;诱饵靶基因可以是一段基因(酶切)或全长基因

6-8周

通过BD-X诱饵

测试自我激活

测试诱饵基因的自我激活能力和毒性

酵母双杂交筛选并获得识别猎物

文库筛选和交互验证,阳性克隆的分离提取和DNA的测序

交付

阳性克隆若干及DNA测序结果,每个阳性克隆不少于2 μg质粒


推荐服务

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酵母双杂交服务常见问题解答

  • 酵母细胞的转化效率较低,导致构建的双杂交文库质量不高。

    优化DNA转化条件,包括DNA质量、细胞密度、电穿孔参数等;尝试使用不同的转化方法,如化学转化、电穿孔转化等,选择适合的转化方法提高转化效率。

  • 构建的双杂交文库中存在非特异性杂交现象,影响筛选结果的准确性。

    优化文库构建过程,包括DNA片段的选择、杂交条件的优化等,减少非特异性杂交的发生;设计合适的对照实验,用于区分特异性杂交和非特异性杂交。

  • 可能出现假阳性结果,即被筛选出的阳性相互作用并非真正存在。

    加强阳性相互作用验证,采用多种方法确认筛选结果的准确性;设计合适的对照实验,用于区分真实阳性和假阳性;优化筛选条件,减少假阳性的发生。

  • 在双杂交筛选过程中,可能会遇到筛选效率低的情况,导致无法获得目标阳性相互作用蛋白。

    优化筛选条件,包括培养基成分、温度、杂交时间等,提高筛选效率;考虑使用高通量筛选技术,如蛋白质微阵列、下一代测序等,提高筛选效率和准确性。

立即咨询酵母双杂交服务

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