认识血栓性血小板减少性紫癫的治疗靶点-抗体改造与修饰专题-泰克生物-酵母展示服务专家

认识血栓性血小板减少性紫癫的治疗靶点

TTP介绍

血栓性血小板减少性紫癜（TTP）是一种急性、罕见的血液病，表现为微血栓形成、血小板减少、机械性溶血以及多脏器损伤。其病理机制通常涉及一种被称为ADAMTS13的金属蛋白酶的缺乏或功能失常。ADAMTS13负责切割血浆中的超大胶原蛋白（vWF），如果ADAMTS13活性降低，vWF的超大分子就会在血管内形成微血栓，导致血小板聚集并诱发血小板减少。微血栓可进一步引发血管内的红细胞破裂（机械性溶血），从而产生贫血。

TTP根据发病机制可分为:（1）罕见的遗传性先天性TTP（cTTP）和由ADAMTS13基因突变导致引起的TTP；（2）获得性自身免疫性TTP（iTTP），由自身缺陷ADAMTS13引起。

VWF蛋白

VWF是一种血浆糖蛋白，由血管内皮细胞和巨核细胞产生，在血小板聚集和凝血过程中起着重要作用。VWF基因位于12号染色体，长度约为180kb，包含52个外显子和51个内含子。VWF基因主要在血管内皮细胞和巨核细胞中表达。

VWF蛋白包含A1结构域和A2结构域，A1结构域与血小板膜糖蛋白Ibα（GPIbα）相互结合，参与血小板粘附过程；A2结构域含有ADAMTS13裂解位点。VWF与ADAMTS13结合，裂解A2结构域的特定肽键，将超大VWF多聚体裂解为分子量较小的VWF多聚体，避免超大多聚体（>20,000 kDa）积聚。由于PPT患者缺乏ADAMTS13，因此无法剪切VWF蛋白，导致VWF在血液中募集过多的血小板，并形成聚集物，导致微血管血栓的发生。

TTP发病机制-泰克生物.jpeg

Fig.1 TTP发病机制

VWF临床表现

VWF最经典的临床症状是贫血和血小板减少，但是部分患者会出现神经系统症状，如头痛、短暂性脑缺血、中风和意识丧失。少部分患者会出现发热、恶心、腹痛和肌酐水平轻度升高的症状。

根据临床表现无法区分iTTP和hTTP，但可以ADAMTS13构象（构象指数>0.5）作为依据，判断iTTP。

VWF抗体

TTP的全球死亡率仍然较高，VWF的靶向策略对TTP的治疗有着较大的前景。TTP的治疗靶点包括ADAMTS13、抗ADAMTS13自身抗体和VWF，其中VWF靶点备受关注。

以VWF靶点作为治疗策略是目前的研究热点，通过阻止VWF结合血小板，从而阻断微血栓的形成。

抗VWF适体-卡普塞珠单抗（Caplacizumab）是一种纳米抗体，通过阻断VWF的A1结构域与血小板GPIbα的结合，阻止了微血栓的形成。Caplacizumab具有较高的安全性和短期疗效。

乙酰半胱氨酸是一种还原酶，通过减少多肽链之间的二硫键，从而改变VWF多聚体的大小，导致黏附血小板的能力降低，适用于置换血浆后。

VWF抗体案例

已有研究报道，天然岩藻聚糖和水解岩藻聚糖对血小板聚集有一定的影响，设计并获得野生型、VWF型和纤维蛋白原缺陷型、gpib α-缺陷型、IL4Rα/ GPIb α-转基因和α IIb缺陷型小鼠和人的血小板，采用盐酸对天然岩藻糖聚糖进行水解，通过层析、紫外可见光谱和荧光光谱技术进行表征。采用流式细胞术检测血小板活化标志物(p -选择素表达、PAC-1和纤维蛋白原结合)和血小板- vwf A1相互作用。采用酶联免疫吸附法评价GPIbα-VWF A1相互作用。western blot检测gpib - ix诱导的信号转导。

将ADAMTS13结构域中的氨基酸残基EDRLPR以点突变技术逐个基因突变（突变体M1~M7），转染至人胚肾HEK293细胞，观察野生型和突变型ADAMTS13在变性条件、剪切应力作用和ADAMTS13抗体处理后裂解vWF的能力。结果表明，采用Western blotting法检测野生型和突变型ADAMTS13，利用Odyssey成像系统显像分析野生型和突变型ADAMTS13相对分子质量。采用荧光共振能量转移（FRET）检测，表明ADAMTS13突变体M4（R635A）和突变体M7（R638A）对FRET-vWF73剪切能力降低，表明ADAMTS13的C末端与vWF之间存在多个结合位点。

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