酵母cDNA表达文库构建服务-泰克生物-酵母展示服务专家

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酵母cDNA表达文库构建服务

泰克生物致力于全新的药物抗体，靶向多肽药物的技术开发服务。我们搭建了完善的酵母表面展示技术系统，经过多年的项目积累后，结合我们靶向肽筛选（细胞筛选，动物体内筛选）的经验，我们特推出了细胞内环境水平互作发现验证体系，即酵母杂交验证体系。化繁为简，我们结合SMART技术和Gateway技术的优势点，为客户提供cDNA酵母文库构建及其衍生出来的系列酵母杂交验证服务。

█ cDNA展示文库构建服务

目前用到的cDNA文库构建方法有两种：SMART技术和Gateway技术。

SMART技术是由Clontech于1996年开发的，SMART技术全称为：Switching Mechanism At 5’ end of RNA Template，即RNA模板5’端转换机制的缩写，是利用反转录酶的模板切换活性，将特异性的序列加到cDNA的5’端，从而提高全长克隆的效率。

Gateway技术是由Invitrogen于1999年开发的，特点是在RNA模板序列两端引入同源重组臂，然后用同源重组（无缝克隆）的形式进行载体克隆，便捷之处在于更换目的序列的构建载体，进行不同宿主系统之间的载体穿梭。

利用上述两种方法均可以单独构建高质量的cDNA展示文库。天津泰克生物擅长利用SMART方法结合同源重组的方式（Gateway方法的同源方式）进行cDNA展示文库的构建工作。如图1所示，SMART方法合成cDNA文库：

酵母cDNA表达文库构建服务-泰克生物1.png

图1 SMART方法合成cDNA文库示意图

█ cDNA展示文库类型

根据客户的要求，泰克生物可以为客户提供均一化cDNA和非均一化cDNA文库构建服务。无论是什么类型的文库，客户均可以指定特定的载体（特定载体需要客户提供空白质粒以及图谱）进行文库构建。泰克生物能够为客户提供的cDNA文库类型如图2所示：

酵母cDNA表达文库构建服务-泰克生物2.png

█ 酵母cDNA展示文库构建

泰克生物为客户提供改进型的SMART cDNA文库构建服务。我们在SMART技术获得cDNA文库，通过在cDNA两端引入同源重组臂的方式进行任意载体的同源重组，借此技术可以获得原核类型的cDNA文库（更多详情请咨询我们的科学家）和真核酵母的cDNA文库，图3所示为酵母类型SMART技术构建的cDNA文库。

酵母cDNA表达文库构建服务-泰克生物3.png

图3 基于改进型SMART技术的酵母展示cDNA文库

█ 酵母cDNA展示文库构建样品要求

客户可根据我们的要求进行样品的准备，也可以直接咨询我们的科学家进行详细沟通。如表1所示，样品准备要求：

样品类型	样品需求	保存条件（℃）	运输条件
细胞样本	细胞数量大于 2*10^7	-80	干冰
动物组织	需要按照我们的指导准备样品	-80	干冰
植物样本	需要按照我们的指导准备样品	-80	干冰
总 RNA	> 50 μg （3条带清晰可见)	-80	干冰

█ 酵母cDNA文库服务内容和周期

步骤	服务内容	周期
Step1：mRNA制备	1) Total RNA提取（条带清晰可见，浓度>0.4ug/ul） 2) mRNA纯化 3) 交付：total RNA质量验证报告，mRNA质量验证报告	1周
Step2：cDNA文库构建服务	1) cDNA 合成与接头连接（三框文库）+cDNA 均一化（可选） 2) 重组到酵母载体 pGADT7 上和电转化 3) 将获得的 cDNA 文库电转化至大肠杆菌感受态细胞中进行克隆扩增，获得初级文库 4) 初级文库验证：单克隆测序进行均一化效果验证 5) 交付： -- 初级cDNA文库，扩增文库质粒（>500ug）; -- 文库库容量 >1*10^7 CFU/ml; -- 平均插入片段 0.8-1.5 kb（不同项目有差异） -- 实验报告，库容滴度结果，测序原始数据	4-5周
Step3：酵母cDNA文库构建服务（可选）	1) 初级文库进行酵母超级感受态制备电转化 2) 文库库容鉴定+单克隆测序 3) 交付： -- 原始酵母cDNA文库甘油菌; -- 文库库容量 >110^6 CFU/ml，文库滴度>210^7 CFU/ml; -- 实验报告，库容滴度结果，测序原始数据	3-5周

█ 酵母cDNA文库构建技术平台服务优势

RNA样本量需求量少，适合珍贵样本

均一化，有效富集低丰度表达基因

文库库容大且多样性高

实验记录可追溯：文库QC质控

标准，中英文实验报告，原始

实验记录

一对一个性化方案定制，根据

客户需求设计最佳的构建方案

酵母cDNA表达文库构建服务常见问题解答

什么是酵母文库的构建？其中SMART技术是什么意思？

答：二十年来，酵母展示方法已成为发现、提高稳定性和亲和力成熟的各种蛋白质支架的常用工具，用于抗原识别。酵母展示特别适用于异二聚体蛋白的选择，例如抗体和T细胞受体（TCR），因为它允许通过间隙修复驱动的同源重组快速创建文库，并在相反交配类型的酵母交配后随后构建组合文库。酵母文库是由许多不同的基因克隆构成，这些基因克隆插入到载体中后，能够在酵母细胞内复制和表达。SMART扩增技术从生物体中提取总 RNA，并采用 RNA 模板 5' 端的转换机制（SMART）技术进行 cDNA 合成。随后，通过长距离 PCR 扩增双链 cDNA，在酵母菌株中纯化并与载体共转化。对构建的文库的质量参数进行评估，以验证构建的文库。
SMART技术的优点有什么？一般的应用是什么？

答：SMART技术即使客户的初始样本RNA的量很少的情况下，我们也可以高质量、高效的完成样本全长cDNA的扩增，这项技术比较适合低丰度表达基因进行克隆。通过一些技术手段的均一化处理后，我们能够发现SMART技术显著降低了基因的冗余度，帮助我们对那些表达量较低的基因进行了有效的富集，这样可以更好的提高我们构建的酵母文库中的基因多样性。SMART技术的操作流程更加简单，操作也更加快捷，有利于科研人员在实验室中快速开展实验。SMART技术利用反转录酶的模板切换活性，在cDNA的5'端加上特异性的序列，这样可以提高全长克隆的效率。泰克生物有严格的质控流程，通过质控流程，泰克生物使用SMART技术构建的酵母文库在库容量、平均插入片段长度以及克隆阳性率等方面均能达到较高的标准，泰克生物的科研人员能够构建出高质量、高可靠性的酵母文库，为客户不同生命科学领域的深入研究提供有力支持。
酵母文库构建服务中，SMART技术对RNA起始量的要求如何？

答：SMART技术之所以在分子生物学领域一直使用，其显著优势之一就是因为它对RNA起始量包容性强。在实验中，这项技术仅仅只需要极低的RNA起始量，通常仅需几微克（μg）的高质量RNA，便能启动并顺利完成复杂的文库构建流程。这一特点对于那些比较珍贵的样本，RNA样品难以获得的项目至关重要，比如说我们常见的稀有细胞类型分析、低丰度基因表达研究或者医院的临床样本资源有限的情况。如果遇到上述情况，SMART技术就能够大大的降低实验的门槛，不会让我们的实验被样本量所限制。尽管SMART技术要求的样本量很低，但是我们还是要注意RNA样本的质量如何，它的质量对于最终构建好的文库的多样性影响重大。因此，在使用SMART技术的情况下，也必须采用严格的RNA提取和纯化方法。
SMART技术构建酵母文库的效率如何？如何保证SMART技术构建的酵母文库的多样性？我们如何解决上述问题

答：SMART技术通过其独特的扩增机制，在RNA的5'端引入反转录酶的切换反应。然而，与某些其他的文库构建技术Gateway重组技术相比，SMART技术在某些方面的构建效率可能不如其他技术。面对这一技术方面的缺点，泰克生物的科研人员进行了积极的探索并优化了实验条件，实验方案的优化包括但不限于调整RNA提取过程中的所需溶剂的比例和提取中的温度控制、控制实验中的反应时间、循环数以及优化反应体系中的pH值等。当我们面对文库多样性不够这个问题，我们发现保证文库多样性的关键在于起始RNA样本的多样性和完整性。在提取的过程中，确保其完整性至关重要，因此，我们必须防止其降解与受到污染。至于文库构建阶段，控制过程中的偏差同样不可忽视，旨在降低特定序列的过度现象，从而有效提升酵母文库的多样性。
在酵母文库构建服务中，我们如何评估SMART技术构建的酵母文库的质量？SMART技术构建的酵母文库要是出现假阳性？我们如何解决

答：在酵母文库构建服务中，SMART技术构建的酵母文库的质量如何直接关系到后续研究的有效性和准确性。首先是文库容量，它可以直接反映了文库中包含的遗传多样性程度，高容量文库能够提供更广泛的基因资源供筛选和研究。接着是插入片段大小，插入的片段关乎文库中的基因片段。同时，一个文库中有多少个阳性克隆也可以评估质量。阳性克隆可以展示出了正确插入目标基因片段的克隆的多少，高的阳性克隆表明高的筛选和成功率。同时，假阳性问题也常常出现在文库构建中，并且不局限于SMART技术。面对假阳性的情况，我们为了减少假阳性，严格把控各种实验条件、对结果进行多重验证和生物信息学分析等。

什么是酵母文库的构建？其中SMART技术是什么意思？

答：二十年来，酵母展示方法已成为发现、提高稳定性和亲和力成熟的各种蛋白质支架的常用工具，用于抗原识别。酵母展示特别适用于异二聚体蛋白的选择，例如抗体和T细胞受体（TCR），因为它允许通过间隙修复驱动的同源重组快速创建文库，并在相反交配类型的酵母交配后随后构建组合文库。酵母文库是由许多不同的基因克隆构成，这些基因克隆插入到载体中后，能够在酵母细胞内复制和表达。SMART扩增技术从生物体中提取总 RNA，并采用 RNA 模板 5' 端的转换机制（SMART）技术进行 cDNA 合成。随后，通过长距离 PCR 扩增双链 cDNA，在酵母菌株中纯化并与载体共转化。对构建的文库的质量参数进行评估，以验证构建的文库。
SMART技术的优点有什么？一般的应用是什么？

答：SMART技术即使客户的初始样本RNA的量很少的情况下，我们也可以高质量、高效的完成样本全长cDNA的扩增，这项技术比较适合低丰度表达基因进行克隆。通过一些技术手段的均一化处理后，我们能够发现SMART技术显著降低了基因的冗余度，帮助我们对那些表达量较低的基因进行了有效的富集，这样可以更好的提高我们构建的酵母文库中的基因多样性。SMART技术的操作流程更加简单，操作也更加快捷，有利于科研人员在实验室中快速开展实验。SMART技术利用反转录酶的模板切换活性，在cDNA的5'端加上特异性的序列，这样可以提高全长克隆的效率。泰克生物有严格的质控流程，通过质控流程，泰克生物使用SMART技术构建的酵母文库在库容量、平均插入片段长度以及克隆阳性率等方面均能达到较高的标准，泰克生物的科研人员能够构建出高质量、高可靠性的酵母文库，为客户不同生命科学领域的深入研究提供有力支持。
酵母文库构建服务中，SMART技术对RNA起始量的要求如何？

答：SMART技术之所以在分子生物学领域一直使用，其显著优势之一就是因为它对RNA起始量包容性强。在实验中，这项技术仅仅只需要极低的RNA起始量，通常仅需几微克（μg）的高质量RNA，便能启动并顺利完成复杂的文库构建流程。这一特点对于那些比较珍贵的样本，RNA样品难以获得的项目至关重要，比如说我们常见的稀有细胞类型分析、低丰度基因表达研究或者医院的临床样本资源有限的情况。如果遇到上述情况，SMART技术就能够大大的降低实验的门槛，不会让我们的实验被样本量所限制。尽管SMART技术要求的样本量很低，但是我们还是要注意RNA样本的质量如何，它的质量对于最终构建好的文库的多样性影响重大。因此，在使用SMART技术的情况下，也必须采用严格的RNA提取和纯化方法。
SMART技术构建酵母文库的效率如何？如何保证SMART技术构建的酵母文库的多样性？我们如何解决上述问题

答：SMART技术通过其独特的扩增机制，在RNA的5'端引入反转录酶的切换反应。然而，与某些其他的文库构建技术Gateway重组技术相比，SMART技术在某些方面的构建效率可能不如其他技术。面对这一技术方面的缺点，泰克生物的科研人员进行了积极的探索并优化了实验条件，实验方案的优化包括但不限于调整RNA提取过程中的所需溶剂的比例和提取中的温度控制、控制实验中的反应时间、循环数以及优化反应体系中的pH值等。当我们面对文库多样性不够这个问题，我们发现保证文库多样性的关键在于起始RNA样本的多样性和完整性。在提取的过程中，确保其完整性至关重要，因此，我们必须防止其降解与受到污染。至于文库构建阶段，控制过程中的偏差同样不可忽视，旨在降低特定序列的过度现象，从而有效提升酵母文库的多样性。
在酵母文库构建服务中，我们如何评估SMART技术构建的酵母文库的质量？SMART技术构建的酵母文库要是出现假阳性？我们如何解决

答：在酵母文库构建服务中，SMART技术构建的酵母文库的质量如何直接关系到后续研究的有效性和准确性。首先是文库容量，它可以直接反映了文库中包含的遗传多样性程度，高容量文库能够提供更广泛的基因资源供筛选和研究。接着是插入片段大小，插入的片段关乎文库中的基因片段。同时，一个文库中有多少个阳性克隆也可以评估质量。阳性克隆可以展示出了正确插入目标基因片段的克隆的多少，高的阳性克隆表明高的筛选和成功率。同时，假阳性问题也常常出现在文库构建中，并且不局限于SMART技术。面对假阳性的情况，我们为了减少假阳性，严格把控各种实验条件、对结果进行多重验证和生物信息学分析等。

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