羊驼纳米抗体制备-纳米抗体专题-泰克生物-酵母展示服务专家

羊驼纳米抗体制备

1993年，在骆驼科动物血清中发现了一种天然的缺失轻链（VL）的抗体，它的结构简单，仅由两条重链（VH）组成，它的体积很小，约为15 kDa，因此被称为纳米抗体（VHH）或单域抗体，后来在羊驼和鲨鱼等动物中也发现了这种抗体。基于独特的结构和广泛的应用前景，纳米抗体的研究成为了一大热点，特别是在药物研发领域，由于纳米抗体的穿透性较强，因此它成为了治疗肿瘤疾病的理想选择，有助于提高药物的疗效并减轻副作用。虽然鲨鱼动物中也存在类似结构的抗体，但由于羊驼等动物易于养殖和免疫，并且利润较高，因此大多数单域抗体生产都是通过羊驼免疫进行的。

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Fig. 1 传统单克隆抗体、重链抗体、纳米抗体结构图

羊驼免疫的优势：

羊驼的免疫系统所产生的针对特定抗原的抗体具有高度的特异性和亲和力，有助于疾病的治疗和诊断。羊驼等骆驼科动物能产生只有重链的纳米抗体，具有耐高温、稳定性强、组织穿透能力强等优点。由于纳米抗体的结构十分简单，因此比较容易对其进行改造，例如抗体人源化，通过在酵母系统中进行纳米抗体的高效表达，能够以较低的成本获得大规模的单域抗体。羊驼免疫后产生的纳米抗体，由于穿透能力很强，因此能够到达一般抗体无法到达的组织深处，有助于肿瘤疾病的治疗。并且，纳米抗体稳定性和水溶性高，能够适应极端的温度和pH值。

纳米抗体文库构建：

纳米抗体文库构建可以通过噬菌体展示技术进行，抗体库分为天然抗体库、免疫抗体库、合成抗体库以及半合成抗体库。从杂交瘤中分离出的RNA经过逆转录后作为抗体基因的扩增模板，在这个过程中含有大量纳米抗体的大型抗体基因文库被创建，之后通过噬菌体展示技术能够进行筛选与鉴定。除此之外，核糖体展示技术与酵母表面展示技术也可以获得高亲和力的纳米抗体。

为了获得高亲和力的纳米抗体，首先要进行动物免疫，要选择适当的羊驼等进行免疫，使用相应的抗原去刺激动物产生针对特定抗原的免疫反应，从而产生具有特异性的B细胞。在一定时间后，从免疫动物的外周血中分离出外周血单个核细胞（PBMC）。提取PBMC中的总RNA，在提取过程中要注意RNA的完整性和纯度。将提取的RNA作为模板，逆转录成cDNA。之后再以cDNA为模板，通过PCR扩增VHH基因，一般会进行两轮PCR扩增以提高抗体的特异性和产量。将扩增的VHH基因片段克隆到噬菌体展示载体中，构建噬菌体展示文库。将构建好的噬菌体展示文库转化到宿主细胞中，如大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞等，使VHH基因在宿主细胞内表达并与噬菌体表面蛋白融合。通过适当的诱导去刺激宿主细胞表达融合蛋白，并将VHH展示在噬菌体表面。利用噬菌体展示平台，通过多轮筛选，从文库中筛选出与特定靶标蛋白具有高亲和力的VHH阳性克隆。最后对筛选出的VHH阳性克隆进行测序分析，获取其基因序列信息。

制备单域抗体的免疫技术：

在对动物进行免疫时，可以利用佐剂去增强抗原的免疫原性，常用的佐剂有弗氏佐剂和水溶性佐剂。弗氏佐剂通过形成油包水乳剂，使抗原在机体内缓慢释放，延长抗原刺激时间，有利于缩短抗体产生的周期，能够非特异性地增强动物对抗原的免疫应答，从而提高抗体的亲和力和产量。但弗氏佐剂被注射后容易引起注射部位发生炎症反应，甚至可能导致组织坏死和溃疡，并且弗氏佐剂不适用于人类疫苗和抗体药物的制备。与弗氏佐剂相比，水溶性佐剂有更低的毒性和更好的生物相容性，适用于人类疫苗和抗体药物的制备，并且水溶性佐剂的制备不需要复杂的乳化过程，制备起来比较简单，水溶性佐剂被注射后引起的局部反应也比较轻。但与弗氏佐剂相比，水溶性佐剂由于不形成油包水乳剂，抗原在体内的释放速度较快，可能导致免疫刺激时间较短，因此需要增加抗原剂量或延长免疫周期去引起机体的免疫应答。

常用的免疫源包括蛋白质免疫原、小分子免疫原、多肽免疫原、病毒型免疫原、DNA/RNA免疫原、细胞系类型免疫原。其中，蛋白免疫原的蛋白质纯度要高，最好能够模拟天然的抗原表位。小分子免疫原需要与较大的载体蛋白质偶联以增强其免疫原性。病毒型免疫原需要确保病毒已被灭活且无法引起疾病。

泰克生物多年来致力于纳米抗体库构建与纳米抗体文库筛选服务，有丰富的单域抗体生产经验。基于我们成熟的抗体发现服务平台，每年都有数百个羊驼纳米抗体文库构建服务成功交付。泰克生物建立了一个完善的、成熟的纳米抗体展示技术服务平台。基于噬菌体展示技术，我们可以提供包括抗原设计、羊驼免疫、羊驼纳米抗体文库构建与筛选、活性功能验证等主要实验环节，并为客户提供高特异性和高亲和力的羊驼纳米抗体文库构建服务。并且我们会对纳米序列信息进行全方面分析并用多种实验验证，如EC50测定，亲和力分析，流式阻断验证等。我们拥有包括M13、T4、T7和λ噬菌体在内的多种噬菌体抗体文库构建平台，可满足客户的不同需要，提供个性化的纳米抗体文库构建服务。泰克生物擅长构建不同类型的噬菌体展示文库，如免疫库、天然库、半合成库、合成库等。我们构建的纳米抗体库库容量庞大，可产生高亲和力的纳米抗体。我们可为客户提供包括pMECS、pComb3X和pCANTAB 5E等多种噬菌粒载体。我们有TG1大肠杆菌、 XL1-Blue和ER2738等菌种，经扩大培养后，可用于噬菌体侵染。我们构建的抗体库库容量庞大，可达10^9，具有较高的目的片段插入率高，有利于筛选出令客户满意的纳米抗体。我们还可根据客户需要，对筛选的纳米抗体进行表达与纯化。除原核表达系统外，我们还有各种的抗体蛋白的真核表达系统，如哺乳动物细胞、酵日细胞、植物和昆虫细胞表达系统等，可为客户生产制备高质量纳米抗体。