浅谈全人源化抗体-抗体改造与修饰专题-泰克生物-酵母展示服务专家

浅谈全人源化抗体

人源化单抗基本解决了鼠抗体的免疫原性问题，但是人源化过程仍很繁复且费用昂贵，需要广泛的计算机模型设计以及大量实验来测定各种氨基酸对目标选择性和结合亲和力的有害作用。为了彻底消除异源性抗体的不良影响，人们将噬菌体展示技术应用到抗体的表达和克隆上，产生了噬菌体抗体库技术。由此，抗体工程技术进入到了一个新的发展阶段，全人源化抗体的生产和应用也逐渐走向成熟。

一．全人源化抗体

全人源化抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的。

二．全人源化抗体的制备途径

1. 展示技术

（1）噬菌体展示技术：该技术利用噬菌体表面展示技术，首先通过PCR扩增出抗体的全套可变区基因，并将其克隆入噬菌体展示载体中，这样抗体基因在噬菌体表面表达并展示在噬菌体表面。再经过多轮“吸附-洗脱-扩增”的过程筛选并富集特异性抗体。这一技术将表型和基因型联系在一起，使抗原识别能力和再扩增结合在一起，是一个极为高效的表达、筛选体系。

（2）核糖体抗体库技术是利用了核糖体展示的基本原理，先将PCR扩增的抗体可变区基因文库，构建到核糖体展示系统中，然后在非细胞翻译系统中进行转录和翻译。由于该系统的特殊性，抗体最终会形成“抗体片段-核糖体-mRNA”复合物，即核糖体展示抗体复合物。然后用相应的抗原对核糖体展示的抗体库进行亲和筛选，筛得复合物通过RT-PCR获得目标抗体基因DNA，所得DNA可以进入下一轮展示筛选，也可以进行测序分析。

（3）酵母抗体库技术通常是使抗体片段分别与a或a-凝集素融合，并将其展示于酵母细胞表面。目前，a-凝集素展示技术的应用较为广泛。酵母抗体库展示技术继承了噬菌体展示的特性，可根据编码蛋白的特性对目的基因进行筛选。酵母展示系统不但可以用传统的生物淘洗方法进行筛选，还可以采用流式细胞分选仪进行筛选，极大的减轻筛选工作量，提高筛选的效率。

2. 转基因小鼠

制备全人抗体的转基因小鼠有几种，包括人外周血淋巴细胞-严重联合免疫缺陷小鼠、转人免疫球蛋白基因组小鼠和转人染色体小鼠。第一种在免疫学研究中应用较广泛，但在制备全人抗体的报道较少；后两者始于20世纪后期，技术难度较大，但因可制备完整的高亲和力的人抗体分子，故倍受关关注。

3. 单细胞PCR

单细胞PCR构建全人源性单克隆抗体技术，是通过单细胞RCR技术直接获得单个目标B细胞中抗体轻、重链可变区基因，然后把它们重组到含人IgG轻、重链恒定区的表达载体上，再通过转染哺乳动物细胞进行表达，制备针对特定抗原的全人源单克隆抗体。

单细胞PCR构建全人源单克隆抗体技术的基本流程如下：（1）采集疫苗免疫或已有免疫应答个体的外周血或骨髓单核细胞。（2）通过B细胞表面特异性的分子标记物，采用流式细胞仪、免疫磁珠分选等方法得到抗原特异性的浆细胞或记忆性B淋巴细胞。（3）通过单细胞RT-PCR和Nested PCR方法扩增细胞中的抗体轻、重链可变区基因，测序并鉴定。（4）将抗体轻、重链可变区基因克隆入含有人源抗体轻、重链恒定区基因的真核表达载体中，转染293T细胞等进行抗体表达。（5）表达产物鉴定。可通过Western blot、间接ELISA等方法检测抗体与相应抗原的特异性结合活性；通过细胞试验或动物试验检测抗体的生物学功能。

三．人源化抗体的应用

1.在自身免疫性疾病方面的应用

在对自身免疫疾病的治疗中，人源化的单抗药物通过清除激活的细胞，阻滞其功能，或将升高的促炎细胞因子水平降至正常水平而抑制过度的免疫病理学反应。现有的研究表明，抗体对系统性红斑狼疮、多发性硬化、风湿性关节炎和溃疡性结肠炎都有良好的治疗效果，并且随着技术发展将会应用于更多疾病的治疗。

2.在肿瘤治疗方面的应用

一些人源化的单克隆抗体的研制，主要是针对那些与肿瘤发生、发展相关的靶分子，如治疗非霍奇金淋巴瘤的抗CD20的嵌合抗体Ritu以及针对肿瘤靶位VEGF、CD33等研发的人员化抗体。这些靶分子在正常细胞有表达,但在部分肿瘤细胞中高/低表达，因此可作为肿瘤特异的标志物。

3.在器官移植中的应用

将一些研制的人源化单抗应用于器官移植，可减轻移植后发生的排斥反应，以保护移植器官的功能，如治疗性抗体类药物抗CD3.单抗即被用于心脏、肾脏和肝脏移植排斥的逆转。

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