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文库筛选(细胞筛选)相关问题

一.细胞筛选的技术难点

 

在细胞(或组织)上筛选噬菌体展示基因文库的主要挑战在于细胞表面含有大量受体和蛋白质。与筛选固定抗原不同,细胞表面的大量蛋白质和某些蛋白质组分的高丰度很容易干扰过表达抗原的细胞的筛选,甚至难以分离出目标抗体。

 

二.如何提高细胞筛选效率?

 

1. 降低背景信号的干扰:用相应的阴性细胞系(negative cell line)或组织进行背景扣除,这是一个负选择的过程。影响本底消除效果的主要因素有:用于本底消除的细胞系选择和细胞数量、细胞/噬菌体比例、结合和洗涤条件、噬菌体和细胞分离方法以及选择轮数。在实际操作中,如何设置阳性和阴性选择取决于所用噬菌体抗体库的类型和库容量、细胞或组织类型、抗原过表达水平以及目标抗原的特性。

2. 提高选择的灵敏度和特异性:主要通过优化细胞筛选流程得以实现。除此之外,超大容量的抗体库也是细胞筛选成功的关键。

3. 提高反应性:因为表达量和易变性的原因,细胞表面的肿瘤抗原和受体并不是制备抗体的理想免疫原,因此在原位筛选中必须提高选择的效力以获得相关抗体。

 

三.细胞分选的方法

 

对于在细胞培养板上生长的粘附细胞,噬菌体抗体文库的结合、洗涤和洗脱类似于传统的固相筛选。对于悬浮细胞的分选,可以将噬菌体与待筛选的细胞混合并孵育,并且可以通过低速或差速离心将与噬菌体结合的细胞分离成有机相以回收。对于标记的靶细胞,也可以将阴性选择细胞添加到筛选中,并且可以使用FACS(荧光活化细胞分选)或MACS(磁性活化细胞分选(magnetic activated cell sorting))方法来分选标记的靶细胞。

 

四.细胞筛选的主要应用

 

在对肿瘤抗原和受体等膜蛋白的筛选中,保持天然构象至关重要,固相筛选难以胜任,完整的细胞筛选可以避免构象改变因其的问题。除了完整的细胞外,细胞膜制备物以及肿瘤组织切片上的抗原的靶材料。基于细胞的抗体筛选对肿瘤细胞进行筛选的研究日益广泛。

 

五.细胞材料的选择

 

在细胞筛选的靶点中,有些是经过鉴定,基因序列已知的抗原,有些是尚未进行抗原鉴定的肿瘤细胞株,还有一类是对抗原信息知之甚少的肿瘤组织。对于少数序列和结构清楚的靶点,可以对纯化的抗原或表达的重组蛋白进行筛选,但因为构象变化的原因,以这种方法获得的抗体识别和结合天然状态抗原的能力差别很大。通过细胞转染的方法,可将抗原蛋白定位至细胞表面,以完整细胞或细胞裂解物为靶材料,可以筛选出特异性抗体。

 

六.抗体库的选择

 

在对细胞进行的抗体筛选中,可以使用由免疫动物B细胞中扩增获得的抗体基因制备的免疫抗体库,也可用无抗原倾向性的天然抗体库、合成库及半合成库。免疫抗体库的制备简单,其编码序列的抗原倾向性强,筛选的背景简单,因此有望在库容有限的情况下快速得到高亲和力的抗体,不便之处在于,对于每种抗原都需要重新免疫和建库,但有些抗原,由于免疫耐受或者毒性原因,很难奏效。此时可以选择大容量非免疫库或者合成库完成筛选,特别是对于未知抗原和免疫原性很低的自身抗原,提高库容以增加成功筛选的机会至关重要。天然库和全合成大容量抗体库序列构成无倾向性,容量大,且能克服体内抗体重组过程中对自身抗体的抑制,因此适用性广。半合成抗体库中抗体分子的一条链(一般为轻链)序列固定,仅在重链中引入多样性,因此所构建的抗体库可能具有抗原倾向性。

 

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